申请/专利权人：温氏食品集团股份有限公司

申请日：2017-06-20

公开（公告）日：2021-01-08

公开（公告）号：CN107446951B

主分类号：C12N15/863(20060101)

分类号：C12N15/863(20060101);C12N15/90(20060101);C12N7/01(20060101);A61K39/295(20060101);A61K39/275(20060101);A61K39/235(20060101);A61P31/20(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.01.08#授权;2018.11.06#著录事项变更;2018.01.05#实质审查的生效;2017.12.08#公开

摘要：本发明涉及生物技术领域，具体是指一种通过CRISPRCas9系统快速筛选重组鸡痘病毒的方法及其应用。所述方法步骤包括：设计靶基因的sgRNA双链寡核苷酸序列；将所述序列与线性化的质粒载体连接，得到sgRNA表达载体；将sgRNA表达载体、表达外源基因的重组鸡痘病毒质粒、鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞CEF；纯化并验证纯化效果。本发明通过CRISPRCas9方法将重组鸡痘病毒筛选代次降低至3‑4代，大大提高了疫苗生产的效率，操作简便，降低了生产成本。

主权项：1.一种通过CRISPRCas9系统快速筛选重组鸡痘病毒的方法，所述重组鸡痘病毒包含SEQIDNO：1所示的载体，其特征在于，所述方法步骤如下所示：1选取靶基因序列；2根据1中靶基因序列设计两条反向互补的上下游引物；分别在上下游引物5’端加上CCGG和AAAC，即为sgRNA双链寡核苷酸序列；所述sgRNA双链寡核苷酸序列分别为SEQIDNO：10和SEQIDNO：11；3将2中靶基因的sgRNA双链寡核苷酸序列与线性化的质粒载体连接，转化提取得到sgRNA表达载体；4将3中sgRNA表达载体、表达外源基因的重组鸡痘病毒质粒、鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞；5将4中细胞经过3-4代纯化从而得到表达外源基因重组鸡痘病毒；所述纯化为用X-gal进行蓝白斑筛选纯化，纯化直至出现的空斑全部为蓝斑；并验证纯化效果。

全文数据：一种通过CRISPRCas9系统快速筛选重组鸡痘病毒的方法及其应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体是指一种通过CRISPRCas9系统快速筛选重组鸡痘病毒的方法及其应用。背景技术[0002]鸡痘病毒基因组的高保守区的非复制区域可以整合外源DNA，已经成为普遍的表达载体，在病毒分子生物学、载体疫苗生产等领域得到广泛应用。鸡痘病毒载体疫苗不仅能预防鸡痘的发生，而且还能通过插入其他病原的保护性抗原基因，诱导表达插入基因提高相对应病原的免疫抵抗力。由于重组鸡痘病毒所表达的外源基因在机体内随载体病毒的复制而表达，与灭活疫苗相比，免疫剂量小，接种方法简单，免疫一次能获得长期的免疫效果，很大程度上降低了生产成本。目前，国内外已有多种表达外源基因的重组鸡痘疫苗得到生产应用。[0003]CRISPRCas9是继第一代人工核酸内切酶一锌指核酸酶（zinc-fingernucleases，ZFN和第二代人工核酸内切酶一转录激活因子样效应因子核酸酶transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALEN后产生的第三代人工核酉爱内切酶，可用于各种复杂基因组的定点修饰，修饰类型包括基因的定点突变、基因定点插入、多个位点同时突变和小片段的缺失（TremblayJP.TheCRISPRsystemcancorrectormodifytheexpressionofgenesresponsibleforhereditarydiseases.MedSciParis2015；31II:1014-22.SpencerNY1YanZ1CongL1ZhangY1EngelhardtJF,StantonRC.Definitivelocalizationofintracellularproteins:NovelapproachusingCRISPR-Cas9genomeediting,withglucose6-phosphatedehydrogenaseasamodel.AnalBiochem2016;494:55-67.。目前，CRISPRCas9已成功应用于小鼠、斑马鱼和人类细胞甚至细菌的基因组精确编辑（LiJF，ZhangD，SheenJ.TargetedplantgenomeeditingviatheCRISPRCas9technology.MethodsMolBiol2015;1284:239-55·。由于CRISPRCas9技术具有突变效率高、制作简单而且成本低廉等优势，已被公认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。[0004]0?15?1?^389系统的工作原理是^1?财（0?15?1?-164¥611?麻）通过碱基配对与tracrRNAtrans-activatingRNA结合形成tracrRNAcrRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNAshortguideRNA，足以引导Cas9对DNA的定点切割。目前，有报道显示通过CRISPRCas9对痘病毒进行切割抑制病毒复制，但在提高重组鸡痘病毒筛选方面还没有报道王娇娇，张新敏，倪爱民等CRISPRCas9切割痘病毒DNA抑制病毒复制中国细胞生物学学报ChineseJournalofCellBiology2016,38⑷）。在重组鸡痘病毒的构建过程中，目前使用的方法是使用脂质体或电转等方法将含有表达外源基因的质粒与鸡痘病毒共转染，再通过报告基团EGFPUacz进行空斑筛选，要经过十几代的筛选才能得到纯的重组鸡痘病毒，生产周期长。足见，现有技术有待改善。发明内容[0005]有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供了一种通过CRISPRCas9系统快速筛选重组鸡痘病毒的方法及其应用，通过CRISPRCas9系统方法将重组鸡痘病毒筛选代次降低至3-4代，大大提高了疫苗生产的效率。[0006]本发明目的通过以下技术方案实现：[0007]一种通过CRISPRCas9系统快速筛选重组鸡痘病毒的方法，其方法步骤如下所示：[0008]1选取靶基因序列：根据重组鸡痘病毒同源重组序列，选取待编辑序列，在待编辑序列上游寻找PAM位点，用Cas9核酸酶识别的PAM位点上的序列为NGGN:A、T、C、G，该PAM位点上游的20个碱基序列为靶基因序列；[0009]2根据靶基因序列设计SgRNA序列，为两条反向互补的上下游引物，再分别在上下游引物5’端加上CCGG、AAAC即为SgRNA双链寡核苷酸序列;所述SgRNA双链寡核苷酸序列结构为：[0010]Forward〇Iigo:5’CCGG......3’[0011]Reverseoligo:5’AAAC......3’；[0012]其中“......”代表引物序列；[0013]3将靶基因的SgRNA双链寡核苷酸序列与线性化的质粒载体（clontech产品〇11116-;^1¥0?13?1?089881?祖克隆、表达系统中线性化质粒。611丨16-;[1：-286代6111¥631:01·连接，转化提取得到sgRNA表达载体；[0014]4按照脂质体转染法步骤，将上述sgRNA表达载体、表达外源基因的重组鸡痘病毒质粒、鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞CEF;[0015]5将表达外源基因重组鸡痘病毒再经过3-4代纯化从而得到表达外源基因重组鸡痘病毒并验证纯化效果。[0016]进一步的，步骤⑶中具体操作步骤包括：[0017]3.1先将上述步骤⑵中的sgRNA双链寡核苷酸序列分别稀释；[0018]3.2将（3.1中稀释的sgRNA双链寡核苷酸序列与Guide-itOligoAnnealingBuffer寡核苷酸退火缓冲液进行PCR反应；[0019]3.3将（3.2中所得的PCR反应产物用Guide-itOligoAnnealingBuffer做100倍稀释；[0020]3.4将3.3所得稀释产物进行连接反应；[0021]3.5将3.4的连接产物进行转化放映，即得sgRNA表达载体。[0022]进一步的，所述步骤3.1中sgRNA双链寡核苷酸序列的稀释浓度均为lOOymolL。[0023]进一步的，所述步骤（3.2中PCR反应体系为：sgRNA双链寡核苷酸序列各Iul、Guide-itOligoAnnealingBuffer:8ul〇[0024]进一步的，所述步骤3.2中PCR反应程序为:95°C，2min;然后IOmin内缓慢退火从85°C退至30°C;然后25°C时停止。[0025]进一步的，所述步骤3.4中连接反应的反应体系为:步骤3.3中所得的稀释液：Iul、pGuide-itVectorLinear7·5ngul:2ul、ddH2〇:2ul、DNALigationMightyMixDNA连接混合液）：5ul。[0026]进一步的，所述步骤3.4中连接反应的反应条件为:16°C反应30min。[0027]进一步的，所述步骤3.5中转化操作包括:取5ul步骤3.4中所得的连接反应产物于50ulDH5a感受态中，冰浴30min，42°C热激90s，冰浴2min，加500ulLB培养基于37°C摇床中，130rpm活化30min。[0028]进一步的，上述通过CRISPRCas9系统快速筛选重组鸡痘病毒的方法在疫苗制备中的应用。[0029]—种利用本发明方法筛选的重组鸡痘病毒制备的载体疫苗。[0030]本发明有益效果：[0031]CRISPRCas9在基因编辑上具有效率高、操作简便、成本低等特点，本发明通过CRISPRCas9方法将重组鸡痘病毒筛选代次降低至3-4代，大大提高了疫苗生产的效率，降低了生产成本。附图说明[0032]图1重组病毒rFPV-FADV4fiber2转移质粒图谱。[0033]图2重组病毒rFPV-FADV4fiber2感染CEF后蚀斑图。[0034]图3TYB引物鉴定重组病毒rFPV-FADV4fiber2PCR结果。1-4:单独转移载体rFPV-FADV4fiber2与FPV共转染CEF细胞后纯化第3、7、9、12代后抽提DNA;5-7:转移载体rFPV-FADV4fiber2、表达SgRNA的CRISPRCas9质粒以1:1比例与FPV共转染CEF细胞纯化第3、4、5抽提的DNA;8:转移载体rFPV-FADV4fiber2阳性对照;9:FPVDNA阳性对照；10:DL10000。[0035]图4为FADV4fiber2引物鉴定重组鸡痘病毒rFPV-FADV4fiber2PCR图。I:质粒pMD22-TYB-lacz-F4与鸡痘病毒共转染CEF细胞纯化第7代抽提的DNA;2:质粒pMD22-TYB-lacz-F4和CRISPRCas9表达质粒以1:1比例与鸡痘病毒共转染CEF细胞纯化第4代抽提的DNA;3:阳性4:阴性5:DL2000。[0036]图5为重组鸡痘病毒rFPV-FADV4fiber2感染CEF细胞的fiber2基因表达验证试验结果。[0037]图6为正常CEF细胞的fiber2基因表达验证试验结果。[0038]图7为感染了鸡痘病毒的CEF细胞的fiber2基因表达验证试验结果。具体实施方式[0039]为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现以CRISPRCas9系统快速筛选表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒（rFPV-FADV4fiber2为例进行具体实施例和相关资料的进一步阐述。需要说明的是，本发明实施例仅采用表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒rFPV-FADV4fiber2为例，本发明方法不仅局限于用于快速筛选表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒（rFPV-FADV4fiber2，也可用于其他病毒和其他基因，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。[0040]实施例1[0041]1.材料[0042]1.1病毒毒株和细胞[0043]鸡痘病毒鹌鹑化弱毒株CVCCAV1003购自本公司大华农生物科技公司，鸡4型腺病毒毒株由鸡场分离并保存，鸡胚成纤维细胞CEF用温氏公司的SPF鸡胚制备。[0044]1.2质粒和菌种[0045]感受态JM109购自宝生物公司，表达FADV4fiber2重组鸡痘病毒（rFPV-FADV4fiber2转移质粒pMD22-TYB-lacz-F4为自行构建，构建流程见图1。[0046]1.3主要试剂[0047]CRISPRCas9试剂盒、IPTG、X-gal购自TAKARA公司，DNA回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司，DNA抽提试剂盒购自Axygen公司，胎牛血清（FCS和DMEM培养基购自Thermo公司，转染试剂购自life公司。[0048]2.方法步骤：[0049]2.1、选取靶基因序列[0050]重组鸡痘病毒转移质粒pMDTYB22-lacZ-F4构建其构建路线路见图1，具体步骤如下：[0051]1构建含同源重组臂基因的质粒pMD-TYB:以购自本公司大华农生物科技公司的鹌鹑化弱毒株CVCCAV1003鸡痘病毒疫苗所抽提的核酸作为模板，使用引物设计软件premier5.0根据GenBank上FPV毒株（GenBank:AF198100.1的序列设计引物LTYB-FR、RTYB-FR见表1分别扩增左右同源臂序列，先将扩增的左同源臂序列（SEQIDN0:3TA克隆至pMD19T-Simple载体，为质粒pMD-LTYB，再将扩增的右同源臂序列（SEQIDN0:4插入到NotI和EcoRI位点间，为含有左右同源重组臂的质粒pMD-TYB;[0052]2构建质粒pMD22:合成含鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2、P11启动子的多克隆位点序列（SEQIDN0:6，并通过TA克隆至pMD19T-Simple载体中，形成质粒pMD22;[0053]3构建质粒pMD22_lacz:以质粒pSVKalactosidaseControlVector为模板，设计引物lacz-FR见表1扩增Iacz序列（SEQIDN0:7，使用infusion酶将扩增的Iacz序列插入质粒PMD22的XhoI位点，形成质粒pMD22-lacz;[0054]⑷构建中间载体pMD22-TYB-lacz:将质粒pMD22-lacz、pMDTYB用NotI酶切连接，形成含有左右同源臂、鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2的多克隆位点、Pll启动下Iacz基因的中间转移载体pMD22-TYB-laczSEQIDN0:8;[0055]5扩增FADV4fiber2基因：根据FADV4HB151株fiber2基因序列设计引物F4-fiber2-FR见表1;以本公司某鸡场米集样品分离的病毒，并标号为F4的毒株为模板扩增FADV4fiber2基因，所得扩增产物序列为SEQIDN0:9所示；[0056]6构建重组鸡痘病毒转移载体pMD22-TYB-lacz-F4:将（5中所得的FADV4fiber2基因（SEQIDN0:9插入到质粒pMD22-TYB-laczSEQIDN0:8的SmaI位点，即得表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体pMD22-TYB-lacz-F4,序列如SEQIDNO:1所示；[0057]在构建上述质粒pMD22-TYB-lacz_F4过程中，根据鸡痘病毒FPV毒株GenBank:AF198100.1序列先选择鸡痘病毒的一段非复制必需区（见序列SEQIDN0:2作为同源重组位置TYB，再在这个序列基础上选择左同源臂LTYBSEQIDNO:3和右同源臂RTYBSEQIDN0:4，同时在左右同源臂间预留一小段序列作为设计SgRNA序列的待编辑序列（SEQIDNO:5，在待编辑序列中寻找PAM位点，Cas9核酸酶可识别的待编辑序列中的PAM序列为NGGN:A、T、C、G，PAM位点上游的20个碱基序列为靶基因序列。[0058]表1引物序列表[0060]2.2根据靶基因序列设计合成SgRNA序列[0061]根据革巴基因序列运用cIontech网上设计软件（http:crispr.mit.edu设计SgRNA序列，为两条反向互补引物;再在上游引物5’端加上CCGG四个碱基，在下游引物5’端加上AAAC四个碱基，设计合成SgRNA双链寡核苷酸序列，序列分别为SEQIDNO:10和SEQIDN0：11：[0062][0063][0064]2.3将上述合成sgRNA双链寡核苷酸序列连接至线性化表达载体上[0065]将上述SEQIDNO:10和SEQIDNO:11按照TAKARA公司CRISPRCas9试剂盒方法通过变性、退火之后连接至线性化质粒pGuide-it-ZsGreenlVectorLinear7.5ngul上，步骤如下所示：[0066]⑴先将SEQIDN0:10和SEQIDN0:ll分别稀释至浓度为100μmolL;[0067]2在200ulPCR管中配以下体系（总计IOul:[0068]SEQIDNO：10100ymolL：IuUSEQIDNO：11100ymolL：luKGuide-itOligoAnnealingBuffer寡核苷酸退火缓冲液）：8ul;[0069]在PCR仪中按以下程序反应:95°：，211^11;然后1〇1^11内缓慢退火从85°：退至30°：;然后25°C时停止，双链DNA形成；[0070]3将上述反应产物Iul加至99ulGuide-itOligoAnnealingBuffer中，混勾；稀释退火形成的双链DNA，稀释液备用；[0071]⑷连接[0072]反应体系（总计IOul如下：（3中所得稀释液Iul、pGuide-it_ZsGreenlVectorLinear7.5ngul线性化质粒2ul、ddH202ul、DNALigationMightyMixDNA连接混合液5ul;[0073]反应条件：16°C连接反应30min;[0074]5转化:取5ul⑷中所得的连接反应产物于50ulDH5a感受态中，冰浴30min，42°C热激90s，冰浴2min，加500ulLB培养基于37°C摇床中，130rpm活化30min;再取IOOul菌液涂于含有氨苄青霉素的LB板上，37°C培养16h左右，挑取单个克隆，溶于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，按照OMEGA质粒小量抽提试剂盒说明书抽提质粒。[0075]2.4阳性质粒判断[0076]将抽提的质粒使用试剂盒中引物dGuide-itSequencingPrimer1序列NO:8送测序公司测序，根据测序所得序列寻找CCGG碱基后面20个碱基是否为序列：AATGGACTATCATATGCTTACCGT，若是则为阳性质粒，即为表达sgRNA的CRISPRCas9表达质粒。[0077]2.5将表达FADV4fiber2重组鸡痘病毒转移质粒pMD22-TYB-lacz-F4、表达sgRNA的CRISPRCas9表达质粒与鸡痘病毒共转染CEF细胞，同时设置单独的转移质粒pMD22-TYB-lacz-F4与鸡痘病毒共转染CEF细胞作为对照，具体操作如下：[0078]先制备好CEF细胞:①将选好的两枚9-10日龄的发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘;②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏;③再用PH7.2的PBS冲洗两次;④用手术剪剪成小块2-3mm，用PH7.2的PBS冲洗两次;⑤约加20ml0.25%胰酶溶液，37°C消化15min，期间5min轻摇一次；⑥消化结束，将细胞消化倒入带6-8层纱布的IOOml烧杯中过滤；⑦将过滤液2000rpm离心5min，弃去上清液，将细胞用含10%FCS的DMEM培养基溶解;⑧用适当体积接于细胞培养皿中，37°C，5%CO2培养箱培养；[0079]待CEF细胞长满单层后，接种鸡痘病毒液，37°C，5%⑶2培养箱孵育2h，去病毒液，洗两遍，按照Lipofectamine2000试剂使用说明方法将质粒pMD22-TYB-lacz-F4和CRISPRCas9表达质粒以1:1比例与鸡痘病毒共转染CEF细胞，同时设单独的质粒pMD22-TYB-lacz-F4与鸡痘病毒共转染CEF细胞，待细胞产生80%病变时收集细胞，反复冻融三次，收集重组病毒液。[0080]2.6重组鸡痘病毒的纯化[0081]将上述收集的病毒液用X-gal进行蓝白斑筛选纯化，挑取蓝斑，进行数代纯化直至出现的空斑全部为蓝斑，如图2所示；同时抽提纯化的不同代次的病毒液DNA，用鸡痘病毒同源臂上引物TYB-JC-FR见表1及FADV4fiber2引物F4-fiber2-FR见表1分别对样本进行PCR检测，结果如图3、4所示。[0082]图3为引物TYB-JC-FRPCR扩增图：编号8为以转移载体pMD22-TYB-lacz-F4为模板的阳性对照，片段大小为5315bp，编号9为以FPV抽提DNA为模板的对照，大小为703bp，若是PCR结果只出现5315bp条带，则说明病毒为rFPV-FADV4fiber2重组病毒，若是只出现703bp片段，则说明病毒为FPV病毒，若同时出现两条带则说明病毒为rFPV-FADV4fiber2重组病毒与FPV病毒混合病毒，rFPV-FADV4fiber2重组病毒不纯，编号1至4为单独的质粒pMD22-TYB-lacz-F4与鸡痘病毒共转染CEF细胞纯化第4、7、9、12代抽提的DNA，可看出重组病毒纯化至12代才纯化好，编号5、6、7为质粒pMD22-TYB-lacz-F4和CRISPRCas9表达质粒以1:1比例与鸡痘病毒共转染CEF细胞纯化第3、4、5代后抽提DNA，由此结果可看出使用CRISPRCas9表达系统从第3代开始就只有5315bp出有一条条带，及已纯化，可见本发明方法筛选的效率要高很多，节省了时间。[0083]图4为FADV4fiber2引物F4-fiber2-FRPCR检测结果图：编号1为单独的质粒pMD22-TYB-lacz-F4与鸡痘病毒共转染CEF细胞纯化第7代抽提的DNA，编号2为质粒pMD22-TYB-lacz-F4和CRISPRCas9表达质粒以1:1比例与鸡痘病毒共转染CEF细胞纯化第4代抽提的DNA，从PCR结果可看出FADV4fiber2基因已重组到FPV病毒中。[0084]实施例3本发明方法筛选重组鸡痘病毒的方法在制备抗鸡4型腺病毒FPV载体疫苗中的应用[0085]按照图1所示构建好rFPV-FADV4fiber2转移载体，将构建好的载体与上述构建的表达SgRNA的CRISPRCas9质粒按1:1比例共转染已感染鸡痘病毒的CEF细胞，培养，通过X-GAL进行蓝白斑筛选，经过四代筛选得到了纯化好的rFPV-FADV4fiber2病毒，将其在CEF细胞上进行数次传代，收集好病毒液，作为制备抗鸡4型腺病毒FPV载体疫苗提供病毒液，将所收集的病毒液按常规操作制备方法操作，制得抗鸡4型腺病毒FPV载体疫苗。[0086]表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒表达效果的验证：[0087]将上述病毒液中的表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒（rFPV-FADV4fiber2进行多次筛选纯化，将纯化得到的rFPV-FADV4fiber2接种于用24孔板培养的CEF细胞中，置于37°C、5%的二氧化碳培养箱培养，待出现明显病变后，用PBS洗两遍;冷甲醇固定，PBS洗三遍;加1%BSA封闭Ih，用PBS洗三遍;加入1:100稀释的鸡抗FADV4的一抗37°C孵育2h，用I3BST洗三遍;再加入1:200稀释的兔抗鸡IgG-FITC荧光二抗，室温孵育Ih，PBST洗三遍;置于倒置荧光显微镜下观察结果，同时以正常CEF细胞及感染了鸡痘病毒的CEF细胞经同样的方式处理，作为对照。结果如图5-7所示，可以看出只有感染了rFPV-FADV4fiber2的CEF细胞上出现了特异性的绿色荧光，表明重组鸡痘病毒rFPV-FADV4fiber2感染了CEF细胞后有效的表达了FADV4的fiber2抗原。[0088]抗鸡4型腺病毒FPV载体疫苗临床试验验证[0089]本发明还验证了重组鸡痘病毒rFPV-FADV4fiber2纯化得到的疫苗在动物体内的免疫效果，结果显示该重组病毒在动物体内可产生良好的免疫效果。[0090]用重组病毒rFPV-FADV4fiber25XIO5PFU羽经翅皮下注射接种于10天龄的SPF鸡上，同时设空白组、免疫某公司灭活疫苗组做对照，分别于免疫前、免后三周采血，通过ELISA方法检测机体抗体水平变化，步骤如下：用包被缓冲液将表达FADV4fiber2的蛋白稀释至3ygml，每孔加100ul，包被于96孔板中37°〇211，1%834,37°：封闭111，加入所采的稀释了200倍的血清，37°C孵育2h，用I3BST洗三遍，每次洗3min，再加入羊抗鸡HRP酶标记二抗37°C孵育Ih，用I3BST洗三遍，每次洗3min，加底物显色，37°C20min，最后加终止液终止，将板置于酶标仪中，在0D450下读数;结果如下:免疫前整体抗体水平OD值为0.31，免疫后三周，空白组平均OD值为0.27，某公司灭活疫苗为0.75，rFPV-FADV4fiber2重组病毒为0.77，结果显示该重组病毒在动物体内可产生良好免疫应答。[0091]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

权利要求：1.一种通过CRISPRCas9系统快速筛选重组鸡痘病毒的方法，其特征在于，所述方法步骤如下所示：1选取靶基因序列；⑵根（1中据靶基因序列设计两条反向互补的上下游引物;分别在上下游引物5’端加上CCGG和AAAC，即为SgRNA双链寡核苷酸序列;所述SgRNA双链寡核苷酸序列结构为：Forwardoligo:5’CCGG......3’ReverseοIigo：5'AAAC......3’；其中“......”代表引物序列；3将（2中靶基因的sgRNA双链寡核苷酸序列与线性化的质粒载体连接，转化提取得到SgRNA表达载体；⑷将3中sgRNA表达载体、表达外源基因的重组鸡痘病毒质粒、鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞；5将4中细胞经过3-4代纯化从而得到表达外源基因重组鸡痘病毒；并验证纯化效果。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤⑶中具体操作步骤包括：3.1先将权利要求1中步骤⑵中的sgRNA双链寡核苷酸序列分别稀释；3.2将（3.1中稀释的sgRNA双链寡核苷酸序列与Guide-itOligoAnnealingBuffer寡核苷酸退火缓冲液进行PCR反应；3.3将3.2中所得的PCR反应产物用Guide-itOligoAnnealingBuffer做100倍稀释；3.4将3.3所得稀释产物进行连接反应；3.5将3.4的连接产物进行转化放映，即得sgRNA表达载体。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3.1中sgRNA双链寡核苷酸序列的稀释浓度均为l〇〇MiolL。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3.2中PCR反应体系为:sgRNA双链寡核苷酸序列各Iul、Guide_itOligoAnnealingBuffer:8ul〇5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，，所述步骤3.2中PCR反应程序为:95°C，2min;然后IOmin内缓慢退火从85°C退至30°C;然后25°C时停止。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3.4中连接转化的反应体系为：步骤（3.3中所得的稀释液：lul、pGuide_itVectorLinear7.5ngul:2ul、ddH2〇:2ul、DNALigationMightyMix:5ul〇7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3.4中连接反应的反应条件为：16°C反应30min。8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3.5中转化操作包括:取5ul步骤3.4中所得的连接反应产物于50ulDH5a感受态中，冰浴30min，42°C热激90s，冰浴2min，加500ulLB培养基于37°C摇床中，130rpm活化30min。9.根据权利要求1-8任意一项所述的通过CRISPRCas9系统快速筛选重组鸡痘病毒的方法在疫苗制备中的应用。10.—种载体疫苗，其特征在于，所述疫苗利用1-8任意一项所述的通过CRISPRCas9系统快速筛选的重组鸡痘病毒制备。

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