申请/专利权人：中央民族大学

申请日：2016-08-24

公开（公告）日：2021-02-09

公开（公告）号：CN107779501B

主分类号：C12Q1/6883(20180101)

分类号：C12Q1/6883(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.02.09#授权;2018.04.03#实质审查的生效;2018.03.09#公开

摘要：本发明公开了一种基于STIM1基因检测人细胞内钙内流SOCE水平的方法及其专用试剂盒。本发明不仅为进一步研究SNP与疾病易感基因的相关性、SNP与个体对药物敏感或耐受的相关性研究等奠定基础，也为研究突变型STIM1与野生型STIM1所介导的钙内流之间的差异，从而探索STIM1蛋白结构变化所引起的功能变化提供基础。

主权项：1.检测STIM1基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸的物质在鉴定或辅助鉴定表达STIM1基因的哺乳动物细胞内钙内流水平中的应用。

全文数据：一种基于STIM1基因检测人细胞内钙内流SOCE水平的方法及其专用试剂盒技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于STIMl基因检测人细胞内钙内流SOCE的方法及其专用试剂盒。背景技术[0002]细胞信号转导通路（cellularsignaltransductionpathway是指细胞接受外界信号，通过一整套特定的机制，将胞外信号转导为胞内信号，最终调节特定基因表达，并引起细胞的应答反应。钙离子是生物体中最重要的信号分子之一，它参与了如基因转录，肌肉收缩、分泌、能量代谢，细胞增殖、分化、凋亡等所有的细胞生命活动。[0003]钙离子作为细胞内信号分子，静息状态时，通过调控钙离子的内流和外排，细胞内钙离子调控系统将其浓度维持在一个极低的水平，但当细胞受到胞外信号刺激，会使胞内钙离子浓度瞬时提高到一个很高的水平，从而发挥信号功能。钙库调控的钙离子通道store-operatedcalciumchannel，S0CC是非兴奋性细胞f丐离子内流最主要的通道，当细胞内钙库储存的钙离子被释放之后，能够快速活化质膜上的通道，从而使钙库充满，以及维持胞浆内高的钙离子浓度激活的信号；钙库调控的钙离子内流（store-operatedcalciumentry，SOCE参与调节很多生命过程，比如cAMP的产生，T淋巴细胞的活化等，一旦SOCE被破坏，将会引起许多疾病，如免疫缺陷，癌症等。[0004]目前，钙库调控钙内流过程中两个重要蛋白分子被确定为：STIMUstromalinteractionmoleculeI和Orailcalciumrelease-activatedcalciumchannelproteinI。它们对SOCC的调控起主要作用，STMI主要激活通道，Orail蛋白是构成SOCC通道蛋白的主要亚基。STMl是细胞内质网钙库消耗后的感受蛋白，而Orail是细胞膜表面上的钙离子通道蛋白。当钙库清空后，SHMl感受钙库清空状态，聚集并向细胞膜靠近，通过与细胞膜上的Orail相互作用来开放钙通道，形成SOCE进而参与细胞信号的传递，影响细胞多种重要功能。[0005]单核苷酸多态性singlenucleotidepolymorphisms，SNP作为人类可遗传变异中最常见的一种，用于阐释并寻找某种基因变异与表型之间的相关性。单核苷酸多态性是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的序列多态性，在人类基因组中广泛存在，占所有已知多态性的90%以上。开展SHMl基因的SNP研究可以揭示人种、人群和个体间DNA序列的差异，从而在疾病的诊断、预防和个性化治疗中发挥关键作用，具有重要的研究价值。发明内容[0006]本发明的第一个目的是提供检测STIMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸的物质的新用途。[0007]本发明提供了检测STIMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸的物质在鉴定SHMl基因的基因型中的应用；[0008]所述STIMl基因的基因型为AA基因型或GG基因型或GA基因型；[0009]所述AA基因型为STIMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为AA的纯合体；[0010]所述GG基因型为STIMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为GG的纯合体；[0011]所述GA基因型为STIMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体。[0012]本发明的第二个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定STIMl基因的基因型的方法。[0013]本发明提供的鉴定或辅助鉴定STIMl基因的基因型的方法为检测SHMl基因的第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为AA纯合体还是GG纯合体还是GA杂合体，从而鉴定STIMl基因的基因型；[0014]所述STIMl基因的基因型为AA基因型或GG基因型或GA基因型；[0015]所述AA基因型为STIMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为AA的纯合体；[0016]所述GG基因型为STIMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为GG的纯合体；[0017]所述GA基因型为STIMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体。[0018]本发明还提供了检测STIMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸的物质在鉴定或辅助鉴定表达SHMl基因的哺乳动物细胞内钙内流水平中的应用。[0019]本发明的第三个目的是提供了一种鉴定或辅助鉴定表达STIMl基因的哺乳动物细胞内钙内流水平的方法。[0020]本发明提供的鉴定或辅助鉴定表达SIlMl基因的哺乳动物细胞内钙内流水平的方法为检测表达SHMl基因的哺乳动物细胞中SHMl基因的基因型为AA基因型还是GG基因型：GG基因型的哺乳动物细胞内钙内流水平高于AA基因型的哺乳动物细胞；[0021]所述AA基因型为STIMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为AA的纯合体；[0022]所述GG基因型为STIMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为GG的纯合体。[0023]上述方法中，所述检测表达SHMl基因的哺乳动物细胞中SIlMl基因的基因型为AA基因型还是GG基因型的方法为如下A或B:[0024]A直接测序哺乳动物细胞中的STIMl基因；[0025]B测序含有STIMl基因第7外显子的第71位脱氧核糖核苷酸的PCR扩增产物；[0026]所述PCR扩增产物所用的引物为如下1或2:[0027]1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列1所示的单链DNA分子组成的引物对A;[0028]2由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B;[0029]所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；[0030]所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸。[0031]本发明还提供了检测STIMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸的物质在鉴定或辅助鉴定哺乳动物细胞内钙内流水平中的应用。[0032]本发明还提供了检测STIMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸的物质在制备鉴定或辅助鉴定哺乳动物细胞内钙内流水平的产品中的应用。[0033]上述应用中，所述钙内流水平为钙库操纵的钙离子内流SOCE水平;所述钙库操纵的钙离子内流SOCE水平是细胞钙库内的钙离子释放后引发的胞外钙离子流进胞内的反应。[0034]本发明的第四个目的是提供一种鉴定STIMl基因的基因型或鉴定表达STIMl基因的哺乳动物细胞内钙内流水平的产品。[0035]本发明提供的产品为检测STIMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸的物质；[0036]所述STIMl基因的基因型为AA基因型或GG基因型或GA基因型；[0037]所述AA基因型为STIMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为AA的纯合体；[0038]所述GG基因型为STIMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为GG的纯合体；[0039]所述GA基因型为STIMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体。[0040]上述应用或上述产品中，所述检测SHMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸的物质为如下1或2或3或4:[004111由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A;[0042]2由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B;[0043]所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；[0044]所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；[0045]3含有1所述引物对A或2所述引物对B的PCR试剂；[0046]4含有1所述引物对A或2所述引物对B或3所述PCR试剂的试剂盒。[0047]上述应用或上述方法或上述产品中，[0048]所述哺乳动物细胞为离体哺乳动物细胞；[0049]所述离体哺乳动物细胞具体为离体人HEK293细胞系。[0050]本发明通过对人类基因组DNA的提取及STIMl基因的扩增和测序，发现了STIMl基因第7外显子存在SNP位点，并通过定点突变手段研究发现，当SIlMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸基因型为GG时的钙内流水平明显高于基因型AA，说明STIMl基因第7外显子自5'端起第71位脱氧核糖核苷酸的突变对细胞内的信号转导产生影响。本发明不仅为进一步研究SNP与疾病易感基因的相关性、SNP与个体对药物敏感或耐受的相关性研究等奠定基础，也为研究突变型STIMl与野生型STIMl所介导的钙内流之间的差异，从而探索SHMl蛋白结构变化所引起的功能变化提供基础。附图说明[0051]图1为样品DNA样本的琼脂糖凝胶电泳结果。[0052]图2为样品STIMl外显子的琼脂糖凝胶电泳结果。[0053]图3为STIMl第7外显子的测序结果。[0054]图4为突变型STIMl和野生型STIMl的SOCE水平检测。具体实施方式[0055]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0056]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0057]实施例1、一种基于STIMl基因外显子鉴定人细胞内钙内流水平的方法[0058]一、SNP位点的获得[0059]1、血样采集[0060]遵照知情同意的原则，按临床采集标准，取306例健康志愿者的静脉血2mL，置于抗凝采血管内，混匀，统一编号，于-80°C中科美菱超低温冰箱，DW-HL388保存。[0061]2、基因组DNA的提取[0062]采用天隆核酸提取预封装试剂盒Εχ-DNA全血基因组3.0分别对步骤1中获得的血样进行DNA提取。具体步骤如下：[0063]1在蛋白酶K干粉中加入ImL蛋白酶K稀释液，颠倒混匀，使其完全溶解，配制蛋白酶K溶液。[0064]2从试剂盒中取出真空包装的预封装96孔深孔板，颠倒混匀数次使磁珠重悬，去掉真空包装，轻甩孔板，使试剂及磁珠均集中于孔板底部，小心撕去铝箱封口膜。[0065]3于96孔深孔板的槽位1、7列中分别加入200yL血液样品、15yL蛋白酶K溶液、60μL核酸释放剂，采用天隆磁珠核酸提取仪NP968Eppendorf进行自动化提取。[0066]4裂解20min，洗涤3次，每次2-3min，裂解和洗脱温度均控制在65°C。自动化程序结束后，将槽位6、12列的洗脱产物移至无核酸酶离心管中，-80°C低温保存备用。[0067]5通过蛋白核酸测定仪BioPhotometerPlus测定提取DNA的浓度、纯度。通过0.6%琼脂糖凝胶电泳，上样量4yL，电压50V，电泳时间40min，鉴定提取DNA的完整性。部分DNA样本琼脂糖凝胶电泳如图1所示。通过核酸测定仪检测，所提取DNA样本浓度较高，均在60ngAiL以上;OD值260280均为1.80左右，表明所提取DNA中含极少量蛋白质、酚类杂质;OD值260230均高于2.0,表明所提取DNA几乎不受碳水化合物糖类）、盐类或有机溶剂污染；㈤值340均为0，表明所提取DNA无悬浮杂质干扰。[0068]即所得DNA浓度高，样品纯，符合SNP分析的要求。与传统人工提取方法相比，该提取方法时间短，速度快（16例次，30min，并且适合高通量提取。[0069]3、PCR扩增[0070]⑴引物[0071]用在线软件PrimerExplorerV4自动生成的引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，用CldH2O溶解后分装，-20°C冰箱保存备用。引物序列如下：[0072]SHMl-Exon7F:5，-GAGAGTTGGAGCTGTCATTTTC-3,（序列1;[0073]SHMl-Exon7R:5，-GGATCATATTTCAAATTCCTCAC-3,（序列2。[0074]2PCR扩增[00M]分别以步骤2获得的基因组DNA为模板，采用步骤（1中的引物进行PCR扩增，分别得至IjPCR扩增产物，即为人SHMl基因第7外显子。[0076]上述PCR反应体系如表1所示。采用PCR仪Verity96well，美国ABI进行扩增反应，DNAmarkerSM0331为加拿大BBI产品，其他试剂均为生工生物工程上海股份有限公司广品。[0077]表1、50μ1反应体系[0079]上述PCR反应条件如表2所示。扩增完成后，采用1%琼脂糖进行电泳分析，150V、100mA、20min，观察结果。电泳结果如图2所示。从图2中可以看出，条带清晰，扩增效果好。[0080]表2、PCR反应条件[0082]⑶测序[0083]采用PCR产物纯化回收试剂盒生工SK1141进行产物回收和纯化，产物采用测序仪3730XL，美国ABI进行测序分析。[0084]306例样本的基因型检测结果如表3和图3所示。测序结果表明：SIlMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸存在一个SNP突变位点，将STIMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体命名为纯合GG型，将SHMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体命名为纯合AA型，将SHMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体命名为杂合GA型。从表3中可以看出，在306份样本中，纯合GG型有305例，AA型有0例，杂合GA型有1例。[0085]表3、STIM1基因第7个外显子SNP分析结果[0089]实施例2、SNP突变位点与人细胞内钙内流水平性状的相关性分析[0090]一、重组细胞基因型检测[0091]1、质粒的构建[0092]通过定点突变手段，将M091-SnMl-YFP质粒addgene中的人STIMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸对应的位点由G突变成A，得到质粒M091-STIM1Mutation-YFP。[0093]M091-STM1Mutation质粒和M091-SHM1-YFP质粒的区别仅为SHMl基因第7夕卜显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸的不同，M091-SHM1-YFP质粒中的SHMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸为纯合GG型，表达野生型STIMl蛋白；M091-STIM1Mutation质粒中的SIlMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸为纯合AA型，表达突变型SHMl蛋白。[0094]2、重组细胞的构建[0095]分别在HEK293细胞ATCC为CRL-1573中表达M091-SI1M1-YFP质粒和M091-SHM1mutation-YFP质粒，分别得到50个表达M091-STM1-YFP质粒的HEK293细胞和50个表达M091-SHM1mutation-YFP质粒的HEK293细胞。具体步骤如下：[0096]1ΗΕΚ-293细胞的培养[0097]将HEK-293细胞培养于添加10%的胎牛血清的Dulbecco’smodifiedeaglemediumDMEM高糖培养基中，在恒温37°C，5%C〇2的湿润培养箱中培养。[0098]2HEK-293细胞转染前处理[0099]转染前24h，HEK-293细胞经Hank’sBalancedSaltSolutionHBSSGibcoH6648洗涤两次，然后用Trypsin-EDTA0.05%Gibco25200消化处理，并以DMEMHycloneSH30243.01悬起，1200rpm离心5min后用含10%FBS的0PTI-MEMGibco15140重悬，重悬后铺放在六孔板内的盖玻片中。[0100]3转染液的配制[0101]将2ygM091-STIM1-YFP质粒、IOyLIygAiL聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEISigma和OPTI-MEM混匀，得到转染液A。[0102]将2ygM091-STIMlMutation质粒、IOyLlygyL聚乙烯亚胺Polyethylenimine，PEISigma和0ΡΤΙ-ΜΕΜ混勾，得到转染液B〇[0103]4转染[0104]分别于六孔板中的每孔细胞中加入400μ1预先混合20min的转染液A和转染液B，转染时HEK-293细胞的密度约为60-70%，分别得到20个表达腸91-31'頂1-¥??质粒的册1293细胞和20个表达M091-SHM1mutation-YFP质粒的HEK293细胞。[0105]3、检测重组细胞中SNP位点的基因型[0106]按照实施例1中的步骤2和步骤3的方法分别检测上述步骤2获得的表达M091-STMl-YFP质粒的HEK293细胞和表达M091-STM1mutation-YFP质粒的HEK293细胞中的SHMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸。[0107]结果表明：20个表达M091-SHM1-YFP质粒的HEK293细胞中的SHMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸均为G，20个表达M091-STIMlmutation-YFP质粒的HEK293细胞中的SHMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸均为A。[0108]二、重组细胞的钙内流SOCE水平检测[0109]SOCE是细胞钙库内的钙离子释放后引发的胞外钙离子流进胞内的反应，当胞外钙离子通过细胞膜进入细胞时，产生了钙信号S0CE，S0CE的钙信号是信号转导通路中非常重要的组成部分，SOCE的钙信号会影响信号通路下游的多种基因表达，尤其与免疫相关。本发明通过活体细胞荧光成像实验分别检测表达M091-STIM1-YFP质粒的HEK293细胞和表达M091-SHM1mutation-YFP质粒的HEK293细胞的SOCE水平。具体步骤如下：用Fura-2荧光染料孵育细胞1小时，待Fura-2AM充分进入细胞并转换为可结合钙的Fura-2后，交替用340nm和380nm激发Fura-2，并采集5IOnm处的荧光F340，F380，利用F340F380分别测定表达M091-STIM1-YFP质粒的HEK293细胞和表达M091-SHM1mutation-YFP质粒的HEK293细胞内钙离子浓度的变化，进而得到表达M091-STIM1-YFP质粒的HEK293细胞和表达M091-SHMlmutation-YFP质粒的HEK293细胞的SOCE水平F340F380值），结果取平均值。[0110]检测结果如图4所示。从图中可以看出：表达M091-SI1M1-YFP质粒的HEK293细胞内的钙内流水平的平均值明显高于表达M091-SHM1Hiutation-YFP质粒的HEK293细胞内的钙内流水平的平均值，说明当SHMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸基因型为AA时，钙内流水平降低，影响细胞内的信号转导，进一步说明携带该突变型STIMl基因的人可能存在免疫缺陷。

权利要求：1.检测SIlMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸的物质在鉴定STIMl基因的基因型中的应用；所述SHMl基因的基因型为AA基因型或GG基因型或GA基因型；所述AA基因型为SHMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为AA的纯合体；所述GG基因型为SHMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为GG的纯合体；所述GA基因型为SHMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体。2.—种鉴定或辅助鉴定STIMl基因的基因型的方法，为检测STIMl基因的第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为AA纯合体还是GG纯合体还是GA杂合体，从而鉴定STIMl基因的基因型；所述SHMl基因的基因型为AA基因型或GG基因型或GA基因型；所述AA基因型为SHMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为AA的纯合体；所述GG基因型为SHMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为GG的纯合体；所述GA基因型为SHMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体。3.检测STIMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸的物质在鉴定或辅助鉴定表达SHMl基因的哺乳动物细胞内钙内流水平中的应用。4.一种鉴定或辅助鉴定表达STIMl基因的哺乳动物细胞内钙内流水平的方法，为检测表达SHMl基因的哺乳动物细胞中SHMl基因的基因型为AA基因型还是GG基因型:GG基因型的哺乳动物细胞内钙内流水平高于AA基因型的哺乳动物细胞；所述AA基因型为SHMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为AA的纯合体；所述GG基因型为SHMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为GG的纯合体。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述检测表达STIMl基因的哺乳动物细胞中SHMl基因的基因型为AA基因型还是GG基因型的方法为如下A或B:A直接测序哺乳动物细胞中的SHMl基因；B测序含有SHMl基因第7外显子的第71位脱氧核糖核苷酸的PCR扩增产物；所述PCR扩增产物所用的引物为如下1或2:1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列1所示的单链DNA分子组成的引物对A;2由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B;所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸。6.检测STIMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸的物质在鉴定或辅助鉴定哺乳动物细胞内钙内流水平中的应用。7.检测STMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸的物质在制备鉴定或辅助鉴定哺乳动物细胞细胞内钙内流水平的产品中的应用。8.—种鉴定STIMl基因的基因型或鉴定表达STIMl基因的哺乳动物细胞内钙内流水平的产品，为检测SHMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸的物质；所述SHMl基因的基因型为AA基因型或GG基因型或GA基因型；所述AA基因型为SHMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为AA的纯合体；所述GG基因型为SHMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为GG的纯合体；所述GA基因型为SHMl基因第7外显子第71位脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体。9.根据权利要求6或7所述的应用或权利要求8所述的产品，其特征在于：所述检测SHMl基因第7外显子自5’端起第71位脱氧核糖核苷酸的物质为如下1或2或3或4:1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A;2由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B;所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；3含有1所述引物对A或2所述引物对B的PCR试剂；4含有1所述引物对A或2所述引物对B或3所述PCR试剂的试剂盒。10.根据权利要求3所述的应用或权利要求4或5所述的方法或权利要求8或9所述的产品，其特征在于：所述哺乳动物细胞为离体哺乳动物细胞；所述离体哺乳动物细胞具体为离体人HEK293细胞系。

百度查询： 中央民族大学 一种基于STIM1基因检测人细胞内钙内流（SOCE）水平的方法及其专用试剂盒

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