申请/专利权人：苏州天马医药集团天吉生物制药有限公司

申请日：2018-12-26

公开（公告）日：2021-04-27

公开（公告）号：CN109503705B

主分类号：C07K14/605(20060101)

分类号：C07K14/605(20060101);C07K1/36(20060101);C07K1/34(20060101);C07K1/16(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.27#授权;2019.04.16#实质审查的生效;2019.03.22#公开

摘要：本发明公开了一种利拉鲁肽的分离纯化方法，属于分离纯化技术领域。本发明将利拉鲁肽粗品溶于含4～6％有机溶剂的稀氨水中得到粗肽溶液，过滤，滤液分别经过聚甲基丙烯酸酯聚合物填料和八烷基硅烷键合硅胶填料，并结合不同体系的纯化条件进行分离纯化，收集目的产物，最终得到总纯在99.5％以上，最大单杂小于0.1％的产品，此方法简单、收率高，纯度高，非常适合于批量生产。

主权项：1.一种利拉鲁肽的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：1将利拉鲁肽粗品溶于含4～6％有机溶剂的氨水中，得到粗肽溶液，然后过滤；2将步骤1的滤液经过聚甲基丙烯酸酯聚合物填料进行分离纯化，其中A相为10～30mmolL碳酸钠溶液，B相为乙腈，收集主峰样品；3将步骤2收集得到的样品经过八烷基硅烷键合硅胶填料，进行二次分离纯化，其中A相为90～110mmolL硫酸钠溶液，B相为乙腈，收集主峰样品；4将步骤3收集得到的样品采用超滤进行脱盐、浓缩，得到利拉鲁肽；在步骤2中，碳酸钠溶液的pH为8.5～9.5；在步骤3中，硫酸钠溶液的pH为3～4；在步骤1中，有机溶剂为甲醇或乙腈；所述含4～6％有机溶剂的氨水的pH为8.5～9.5。

全文数据：一种利拉鲁肽的分离纯化方法技术领域本发明涉及一种利拉鲁肽的分离纯化方法，属于分离纯化技术领域。背景技术利拉鲁肽是一种长效治疗II型糖尿病的胰高血糖素样肽1GLP-1类似物，属于GLP-1受体激动剂，是首个为II型糖尿病治疗开发的人高血糖素样多肽-1GLP-1类似物。由诺和诺德公司开发研制，并于2010年1月25获得FDA批准上市，于2011年3月4日获SFDA批准在中国上市。利拉鲁肽作为新一代以肠促胰岛素为基础的降血糖药物，不仅作用时间长，而且充分保留了天然GLP-1的多项生理活性，可安全有效降糖并可能对多种心血管危险因素有保护作用，为2型糖尿病的治疗带来了新的选择。临床治疗效果令人鼓舞。目前也有不少针对纯化利拉鲁肽的方法以及相关的专利，但步骤繁琐并且收率很低。本发明提出了一种可得到的利拉鲁肽纯化方法，产品纯度高且收率好且易于产业化。发明内容本发明提供一种利拉鲁肽的分离纯化方法，主要解决了现有技术中分离纯化利拉鲁肽纯度低、收率低及脱盐难的技术问题。本发明的第一个目的是提供一种利拉鲁肽的分离纯化方法，包括如下步骤：1将利拉鲁肽粗品溶于含4～6％有机溶剂的氨水中，得到粗肽溶液，然后过滤；2将步骤1的滤液经过聚甲基丙烯酸酯聚合物填料进行分离纯化，其中A相为10～30mmolL碳酸钠溶液，B相为乙腈，收集主峰样品；3将步骤2收集得到的样品经过八烷基硅烷键合硅胶填料，进行二次分离纯化，其中A相为90～110mmolL硫酸钠溶液，B相为乙腈，收集主峰样品；4将步骤3收集得到的样品采用超滤进行脱盐、浓缩，得到利拉鲁肽。进一步地，在步骤1中，有机溶剂为甲醇或乙腈。优选甲醇。进一步地，所述的含4～6％有机溶剂的氨水的pH为8.5～9.5。优选pH为9。进一步地，在步骤2中，碳酸钠溶液的pH为8.5～9.5。优选pH为9。进一步地，在步骤2中，B相的洗脱梯度为30～45％，梯度洗脱时间为35～45min。优选梯度洗脱时间为40min。进一步地，在步骤3中，硫酸钠溶液的pH为3～4。优选pH为3.2。进一步地，在步骤3中，B相的洗脱梯度为35～50％，梯度洗脱时间为35～45min。优选梯度洗脱时间为40min。进一步地，在步骤2或3中，梯度洗脱时，采用220nm作为检测波长。进一步地，所述超滤采用的滤膜的分子截留量为800～1200D。进一步地，所述的方法还包括冷冻、干燥的步骤。本发明的有益效果是：本发明采用pH在9左右且含4～6％甲醇的稀氨水作为溶解体系。pH在9左右使得利拉鲁肽完全溶解，加入4～6％的甲醇有机溶剂有效的保护填料。本发明采用聚甲基丙烯酸酯聚合物填料，更能耐碱冲洗填料，填料分离度好、填料寿命更长。本发明采用两次纯化，在第一次纯化过程中利用碳酸根离子对利拉鲁肽进行分离，去除主峰后面杂质效果更好，收率更高。第二次纯化过程中，采用硫酸钠溶液进行纯化，并且提高硫酸更浓度明显增加分离度，优化pH值在3.2的最佳条件，使得利拉鲁肽纯度更高。此外，本发明使用超滤脱盐，浓缩，优势在于：分离纯化过程中，样品无损耗、全过程低温保证样品稳定性、浓缩效率更快是旋蒸5-10倍，脱盐效果显著，达到样品和硫酸盐的绝对分离。采用本发明的方法，利拉鲁肽纯化总收率高达65-70％，纯度在99.5％以上，最大单杂不超过0.1％。附图说明图1为固相合成利拉鲁肽粗肽的高效液相色谱图；图2为分离纯化后利拉鲁肽的高效液相色谱图；图3为利拉鲁肽产品的MS图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例1：利拉鲁肽的分离纯化本发明的利拉鲁肽的分离纯化方法，包括如下步骤：1、样品溶解：将10克粗品其中目的肽为4克利拉鲁肽，还包含杂质及一些溶剂，溶剂在HPLC检测结果中没有显示用pH为9且含5％甲醇的稀氨水溶解超声，用0.22um的有机滤膜过滤得到粗品溶液。2、一次纯化：将步骤1滤液经过聚甲基丙烯酸酯聚合物填料进行分离纯化，A相为：20mmolL碳酸钠溶液pH用磷酸调至9，B相为：乙腈，梯度30-45％，梯度洗脱时间为40min，检测波长为220nm，流速为80mlmin，室温，进样为含4克目的产物的粗品。纯化过程：将色谱柱用95％的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为4g目的物。线性梯度洗脱40min，收集目的峰，得到纯度大于95％以上馏分，作为第二步纯化样品，一步收率约为85％左右。3、二次纯化：将一次纯化得到的样品经过八烷基硅烷键合硅胶填料，进行进一步分离纯化，A相为：100mmolL硫酸钠溶液pH用硫酸调至3.2，B相为：乙腈，梯度35-50％梯度洗脱时间为40min，检测波长为220nm，流速为80mlmin，室温，进样为3.4克目的产物的样品。纯化过程：将色谱柱用95％的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为3.4g目的物。线性梯度洗脱40min，收集目的峰，得纯度大于99.5％以上，最大单杂小于0.1％馏分，作为超滤之前的样品，二次纯化步骤收率约为80％。两步收率约在68％左右。4、超滤脱盐：将二纯之后的样品经过超滤膜进行脱盐、低温浓缩、去除硫酸盐，回收得到高浓度样品。5、冷冻、干燥：将样品放进冻干盘，进行冷冻干燥，即可得到99.5％，最大单杂小于0.1％的利拉鲁肽2.7克，纯化总收率为67.5％。实施例2：利拉鲁肽的分离纯化本发明的利拉鲁肽的分离纯化方法，包括如下步骤：1、样品溶解：将10克粗品其中目的肽为4克利拉鲁肽，还包含杂质及一些溶剂用pH为9且含6％甲醇的稀氨水溶解超声，用0.22um的有机滤膜过滤得到粗品溶液。2、一次纯化：将步骤1滤液经过聚甲基丙烯酸酯聚合物填料进行分离纯化，A相为：30mmolL碳酸钠溶液pH用磷酸调至9，B相为：乙腈，梯度30-45％，梯度洗脱时间为40min，检测波长为220nm，流速为80mlmin，室温，进样为含4克目的产物的粗品。纯化过程：将色谱柱用95％的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为4g目的物。线性梯度洗脱40min，收集目的峰，得到纯度大于95％以上馏分，作为第二步纯化样品，一步收率约为81％左右。3、二次纯化：将一次纯化得到的样品经过八烷基硅烷键合硅胶填料，进行进一步分离纯化，A相为：90mmolL硫酸钠溶液pH用硫酸调至3.2，B相为：乙腈，梯度35-50％梯度洗脱时间为40min，检测波长为220nm，流速为80mlmin，室温，进样为3.24克目的产物的样品。纯化过程：将色谱柱用95％的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为3.24g目的物。线性梯度洗脱40min，收集目的峰，得纯度大于99％以上，最大单杂小于0.1％馏分，作为超滤之前的样品，二次纯化步骤收率约为80％。两步收率约在64％左右。4、超滤脱盐：将二纯之后的样品经过超滤膜进行脱盐、低温浓缩、去除硫酸盐，回收得到高浓度样品。5、冷冻、干燥：将样品放进冻干盘，进行冷冻干燥，即可得到99％，最大单杂小于0.1％的利拉鲁肽2.59克，纯化总收率为64.8％。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

权利要求：1.一种利拉鲁肽的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：1将利拉鲁肽粗品溶于含4～6％有机溶剂的氨水中，得到粗肽溶液，然后过滤；2将步骤1的滤液经过聚甲基丙烯酸酯聚合物填料进行分离纯化，其中A相为10～30mmolL碳酸钠溶液，B相为乙腈，收集主峰样品；3将步骤2收集得到的样品经过八烷基硅烷键合硅胶填料，进行二次分离纯化，其中A相为90～110mmolL硫酸钠溶液，B相为乙腈，收集主峰样品；4将步骤3收集得到的样品采用超滤进行脱盐、浓缩，得到利拉鲁肽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1中，有机溶剂为甲醇或乙腈。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含4～6％有机溶剂的氨水的pH为8.5～9.5。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2中，碳酸钠溶液的pH为8.5～9.5。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2中，B相的洗脱梯度为30～45％，梯度洗脱时间为35～45min。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3中，硫酸钠溶液的pH为3～4。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3中，B相的洗脱梯度为35～50％，梯度洗脱时间为35～45min。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2或3中，梯度洗脱时，采用220nm作为检测波长。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超滤采用的滤膜的分子截留量为800～1200D。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括冷冻、干燥的步骤。

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