申请/专利权人：路春光

申请日：2019-11-13

公开（公告）日：2021-05-14

公开（公告）号：CN112795593A

主分类号：C12N15/85(20060101)

分类号：C12N15/85(20060101);C12N5/10(20060101);C12N5/0783(20100101);A61K39/00(20060101);A61P35/00(20060101);A61P31/12(20060101);A61P31/14(20060101);A61P31/20(20060101);A61P1/16(20060101);A61P31/06(20060101);A61P31/18(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2023.09.22#发明专利申请公布后的视为撤回;2021.06.01#实质审查的生效;2021.05.14#公开

摘要：本发明涉及免疫细胞靶向治疗技术领域，传统CAR‑T细胞扩增程序中，通过CD3CD28单抗激活的单核细胞经白介素2进一步扩增后，大多数T细胞为高度分化的效应记忆T细胞，自我更新能力较弱，移植后体内存活时间短，致使治疗效果较差，本研究通过TSCM代替T细胞，扩增后TSCM比例高达44.41%，极大的改善移植后体内免疫细胞的存活时间，提高治疗效果。PiggyBac和SleepBueaty载体容量都远远超过病毒，甚至可以达到100kb以上，几乎可以容下所有我们试图添加的元件，不存在包装环节和序列特异性要求，无论是从CAR‑TSCM未来研发的需求还是从降低成本开拓市场的可能来看，都是最佳的候选者。

主权项：1.一种临床用PB-CAR-TSCM构建方法，其特征在于，包含从新鲜或低温冻存的人体外周血单个核细胞或脐血单个核细胞中分离纯化T细胞，T细胞诱导扩增干细胞样记忆性T细胞（TSCM），通过转座子载体系统搭建这一新CAR-TSCM平台；（1）构建基于PiggyBac的CAR载体PB-CAR-basic，分别以CD19和Her2为靶标，测序验证序列正确；（2）探索PB-CAR-basic电转化TSCM细胞最佳条件，能达到最高转染效率、最佳成活率和最佳细胞毒性，用体外细胞杀伤实验初步证实其功能；优选步骤（2）中电压为200-250v，电转次数1-2次；（3）本发明包括抽取成人血液或采集脐血，用淋巴分离液分离单个核细胞PBMCs或UBMC，CD4+T细胞或CD8+T细胞或CD4-CD8-T细胞，用本人发明的TSCM诱导试剂盒诱导TSCM，直接用不同电转化仪和电转试剂盒，摸索电转化条件，以实现最佳的转化效率、生存率和TSCM细胞状态，并用适当浓度的puro进行筛选，经过扩增后，流式检测CAR-TSCM的状态；优选步骤（3）中，所述TSCM可用于制备CAR-TSCM细胞、UCAR-TSCM、TCR-TSCM或肿瘤浸润性淋巴细胞。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 路春光 新型非病毒载体TSCM基因疗法的构建方法及临床应用

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