申请/专利权人：山西万海澳生物科技有限责任公司

申请日：2019-03-22

公开（公告）日：2021-09-14

公开（公告）号：CN110367038B

主分类号：C12N1/14(20060101)

分类号：C12N1/14(20060101);C12R1/645(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.09.14#授权;2019.11.19#实质审查的生效;2019.10.25#公开

摘要：本发明公开了一种高效抗癌蛹虫草及其生产方法，该方法生产的蛹虫草子实体，用高效液相色谱法定量检测，含喷司他丁≥0.1%，虫草素≥0.1%，而且非常稳定，储存10年内活性成分含量不变。

主权项：1.一种高效抗癌蛹虫草的生产方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：培养内源高表达虫草素的蛹虫草幼苗；S2：用链霉菌制备异源高表达喷司他丁的液体种；S3：异源与内源适时对接与共生培养；培养内源高表达虫草素的蛹虫草幼苗包括以下步骤：S101：配制固体培养基和营养液，所述固体培养基的制备方法是取小麦、莜麦、稻谷三种主料中的一种或者各取三分之一，装入培养容器内，装量为培养容器容积的6~24%，所述营养液的制备方法是马铃薯200g、蔗糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、干松针20g、捣烂的鲜蚕蛹100g加水煮溶取滤液，再加入腺嘌呤1g、甘氨酸16g加水至1000mL；S102：制备培养基，将固体培养基与营养液混匀分装于培养器中，120℃灭菌1.5小时；S103：将各培养器冷却至30℃以下时，在每个培养器内接入蛹虫草母种0.3-0.5cm2菌块3-5块，之后用聚丙烯塑料膜封口，将其置于培养室内变温变光培养35-42天，每日通风一次，每次0.5-1小时，准备异源对接；变温变光具体为：接种封口后前3-7天内闭光培养，温度为16-18℃；8-15天时光照强度为100-200Lx、温度为14-20℃，每天光照时间为12小时；长出子座后，每6小时转换一次光照强度，转换顺序依次为500Lx、1000Lx、1500Lx、2000Lx，温度为18-22℃；用链霉菌制备异源高表达喷司他丁的液体种包括以下步骤：S201：制备链霉菌液体培养基，所述链霉菌液体培养基的制备方法为水100ml、葡萄糖4g、麦芽粉10g、磷酸铵2g、氨基核糖0.3mg、pH值为6.9-7.2，煮溶取滤液，分装在多个三角瓶中，每个三角瓶内的装量为150mL，封口，120℃下灭菌20min；S202：链霉菌种的静态和动态培养及保藏，具体地，在每个三角瓶内接入链霉菌母种0.5-1cm2的菌块2-3块，载于液面，之后将三角瓶置于恒温箱中静置培养48-72小时，恒温箱的温度为28-30℃，当白色孢子散发于液面时，将三角瓶置于摇瓶机上动态培养，温度保持在28-30℃，摇瓶机的转速为250rmin，光照强度为100-200Lx，培养时长为4-6天，形成异源高表达喷司他丁的液体种，将三角瓶置于冰箱内保存，保持温度为4-6℃，保藏时长为60小时；异源与内源适时对接与共生培养包括以下步骤：S301：在S103中35-42天的培养中，当蛹虫草子实体幼苗为3-4cm高，正值旺盛期孕育子囊孢子时，及时接入S2中用链霉菌制备的异源高表达喷司他丁的液体种，具体地，每个三角瓶内均加入无菌水，加入量为异源高表达喷司他丁的液体种的3-4倍量，摇匀后再接入到蛹虫草子实体培养容器内，接入量为固体培养基内主料的1.2-1.4倍量，之后封口；S302：将蛹虫草子实体培养容器置于培养室内进行变温变光共生培养，培养时长为10-15天，每天通风一次，每次通风0.5-1小时；变温变光具体为：前7-12天内，每天以100-200Lx的光照强度光照12小时，温度为20-25℃；最后3天要求每天以500-1000Lx的光照强度光照12小时，保持恒温25℃；S303：当蛹虫草子实体培养基转为灰白色至黄褐色，蛹虫草子实体为4~6cm高并将要散发孢子时，及时采收；S304：加工保藏：将采收的蛹虫草子实体晾干表水，再用20%的干松针水配80%的60度白酒配置的液体均匀喷酒于蛹虫草子实体上，以60℃的温度将其烘干至含水量≤12%后封存；所述蛹虫草母种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNO.5577，保藏时间2011年12月12日；所述链霉菌种购于中国医科学院药生所，编号为CPCC200004。

全文数据：一种高效抗癌蛹虫草及其生产方法技术领域本发明属于食药两用真菌子实体的生产技术领域，具体为一种高效抗癌蛹虫草及其生产方法。背景技术抗癌蛹虫草即含虫草素和喷司他丁均不少于0.1%的蛹虫草子实体。其外表外表金黄色至黄褐色的圆柱体，长4~6cm，上细小粗，底部直径为0.2~0.3cm，尖头，通身多弯曲，断面黄白色或灰白色，有浓郁的菇香气，味微苦。虫草素是蛹虫草中的重要活性成分，具有增强人体免疫力的功能，已被科技界共识。但广泛流传其具有抗癌活性，一直缺乏科学的临床验证，至今未经国家批准为上市药品，只列为新资源食品在市场上流通。喷司他丁是一种拟嘌呤类的抗生素，能抑制肿瘤细胞的合成，并导致其死亡。近40多年来，国内外诸多化学家和生物学家，都在研究化学合成法和生物合成法生产喷司他丁为抗癌药物。然而，其化学合成法路线复杂，原料成本高，收率低；美国于1998年正式将其批准为上市抗癌药品，但仍有诸多难点没有突破，如规模生产难度大，保存期短而不稳定，污染严重等。我国应用生物合成的液体发酵法生产喷司他丁已取得成功，其成本低，收率较高，方法也简便，含量为0.0055%，最高为0.01%，目前尚未成为上市产品。近年来我国真菌学家研究揭示：蛹虫草自身有合成虫草素和喷司他丁的基因簇，在条件具备时，合成虫草素的同时也能合成喷司他丁，这二者是共存相伴的关系；没有后者的保护，前者则降解为其他物质。而且，蛹虫草是目前唯一能通过异源基因与内源基因配合而高表达的生物体。这个分子理论诠释了蛹虫草的抗癌机理：虫草素具有强力免疫功能，喷司他丁具有抑制和致死癌细胞的功能，二者相伴共存于蛹虫草中，蛹虫草则是集抗癌与强身为一体的天然保健食品。然而，蛹虫草的基因簇内源并非无条件地高表达，我国当前产蛹虫草甚多，其活性成份虫草素含量低且极不稳定，有的则为零含量，有点鲜品检测含量高，保存时间短，干品则为低含量，其根源是缺乏喷司他丁的相伴。如何激发蛹虫草基因簇内源的潜能，使其两个活性成份得到高水平的表达，从而得到有效、高产、成本低的抗癌食药品，这是当前发展蛹虫草产业亟待解决的重大课题。发明内容本发明的目的是根据多菌共生的原理，应用具有能产生喷司他丁为次生代谢产物的链霉菌为异源表达材料，激发蛹虫草内源的高表达，高水平地合成虫草素和喷司他丁，进而使蛹虫草内具有稳定高含量的虫草素和喷司他丁。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种高效抗癌蛹虫草及其生产方法，包括以下步骤：S1：培养内源高表达虫草素的蛹虫草幼苗；S2：用链霉菌制备异源高表达喷司他丁的液体种；S3：异源与内源适时对接与共生培养。培养内源高表达虫草素的蛹虫草幼苗包括以下步骤：S101：配制固体培养基和营养液，所述固体培养基的制备方法是取小麦、莜麦、稻谷三种主料中的一种或者各取三分之一，装入培养容器内，装量为培养容器容积的6~24%，所述营养液的制备方法是马铃署200g、蔗糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、干松针20g、鲜蚕蛹（捣烂）100g加水煮溶取滤液，再加入腺嘌呤1g、甘氨酸16g加水至1000mL；S102：制备培养基，将固体培养基与营养液混匀分装于培养器中，120℃灭菌1.5小时；S103：将各培养器冷却至30℃以下时，在每个培养器内接入蛹虫草母种0.3-0.5cm2菌块3-5块，之后用聚丙烯塑料膜封口，将其置于培养室内变温变光培养35-42天，每日通风一次，每次0.5-1小时，准备异源对接。变温变光具体为：接种封口后前3-7天内闭光培养，温度为16-18℃；8-15天时光照强度为100-200Lx、温度为14-20℃，每天光照时间为12小时；长出子座后，每6小时转换一次光照强度，转换顺序依次为500Lx、1000Lx、1500Lx、2000Lx，温度为18-22℃；用链霉菌制备异源高表达喷司他丁的液体种包括以下步骤：S201：制备链霉菌液体培养基，所述链霉菌液体培养基的制备方法为水100ml、葡萄糖4g、麦芽粉10g、磷酸铵2g、氨基核糖0.3mg、PH值为6.9-7.2，煮溶取滤液，分装在多个三角瓶中，每个三角瓶内的装量为150mL500mL，封口，120℃下灭菌20min；S202：链霉菌种的静态和动态培养及保藏，具体地，在每个三角瓶内接入链霉菌母种0.5-1cm2的菌块2-3块，载于液面，之后将三角瓶置于恒温箱中静置培养48-72小时，恒温箱的温度为28-30℃，当白色孢子散发于液面时，将三角瓶置于摇瓶机上动态培养，温度保持在28-30℃，摇瓶机的转速为250rmin，光照强度为100-200Lx，培养时长为4-6天，形成异源高表达喷司他丁的液体种，将三角瓶置于冰箱内保存，保持温度为4-6℃，保藏时长为60小时；异源与内源适时对接与共生培养包括以下步骤：S301：在S103中35-42天的培养中，当蛹虫草子实体幼苗为3-4cm高，正值旺盛期孕育子囊孢子时，及时接入S2中用链霉菌制备异源高表达喷司他丁的液体种，具体地，每个三角瓶内均加入无菌水，加入量为异源高表达喷司他丁的液体种的3-4倍量，摇匀后再接入到蛹虫草子实体培养容器内，接入量为固体培养基内主料的1.2-1.4倍量，之后封口；S302：将蛹虫草子实体培养容器置于培养室内进行变温变光共生培养，培养时长为10-15天，每天通风一次，每次通风0.5-1小时。变温变光具体为：前7-12天内，每天以100-200Lx的光照强度光照12小时，温度为20-25℃；最后3天要求每天以500-1000Lx的光照强度光照12小时，保持恒温25℃；S303：当蛹虫草子实体培养基转为灰白色至黄褐色，蛹虫草子实体为4~6cm高并将要散发孢子时，及时采收；S304：加工保藏：将采收的蛹虫草子实体晾干表水，再用20%的干松针水配80%的60度白酒配置的液体均匀喷酒于蛹虫草子实体上，以60℃的温度将其烘干至含水量≤12%后封存。优选的，所有光照均由LED灯提供；优选的，所述蛹虫草母种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNO.5577，保藏时间2011年12月12日。该菌种为抗退化种专利号：ZL201210248399.6；优选的，所述链霉菌种购于中国医科学院药生所，编号为CPCC200004，抗肿瘤链霉菌也可用构巢曲霉或九洲虫草替代。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明生产的蛹虫草子实体，用高效液相色谱法定量检测，含喷司他丁≥0.1%，虫草素≥0.1%，而且非常稳定，储存10年内活性成分含量不变，是目前国内外双重活性成份最高水平表达的生物体，其成本最低，适于群众性生产，独具中国特色。具体实施方式以下具体实施方式用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若非特别说明，所用的原料和设备均为市售。一种高效抗癌蛹虫草及其生产方法，包括以下步骤：S1：培养内源高表达虫草素的蛹虫草幼苗；S2：用链霉菌制备异源高表达喷司他丁的液体种；S3：异源与内源适时对接与共生培养。培养内源高表达虫草素的蛹虫草幼苗包括以下步骤：S101：配制固体培养基和营养液，所述固体培养基的制备方法是取小麦、莜麦、稻谷三种主料中的一种或者各取三分之一，装入培养容器内，装量为培养容器容积的6~24%，所述营养液的制备方法是马铃署200g、蔗糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、干松针20g、鲜蚕蛹（捣烂）100g加水煮溶取滤液，再加入腺嘌呤1g、甘氨酸16g加水至1000mL；S102：制备培养基，将固体培养基与营养液混匀分装于培养器中，120℃灭菌1.5小时；S103：将各培养器冷却至30℃以下时，在每个培养器内接入蛹虫草母种0.3-0.5cm2菌块3-5块，之后用聚丙烯塑料膜封口，将其置于培养室内变温变光培养35-42天，每日通风一次，每次0.5-1小时，准备异源对接。变温变光具体为：接种封口后前3-7天内闭光培养，温度为16-18℃；8-15天时光照强度为100-200Lx、温度为14-20℃，每天光照时间为12小时；长出子座后，每6小时转换一次光照强度，转换顺序依次为500Lx、1000Lx、1500Lx、2000Lx，温度为18-22℃；用链霉菌制备异源高表达喷司他丁的液体种包括以下步骤：S201：制备链霉菌液体培养基，所述链霉菌液体培养基的制备方法为水100ml、葡萄糖4g、麦芽粉10g、磷酸铵2g、氨基核糖0.3mg、PH值为6.9-7.2，煮溶取滤液，分装在多个三角瓶中，每个三角瓶内的装量为150mL500mL，封口，120℃下灭菌20min；S202：链霉菌种的静态和动态培养及保藏，具体地，在每个三角瓶内接入链霉菌母种0.5-1cm2的菌块2-3块，载于液面，之后将三角瓶置于恒温箱中静置培养48-72小时，恒温箱的温度为28-30℃，当白色孢子散发于液面时，将三角瓶置于摇瓶机上动态培养，温度保持在28-30℃，摇瓶机的转速为250rmin，光照强度为100-200Lx，培养时长为4-6天，形成异源高表达喷司他丁的液体种，将三角瓶置于冰箱内保存，保持温度为4-6℃，保藏时长为60小时；异源与内源适时对接与共生培养包括以下步骤：S301：在S103中35-42天的培养中，当蛹虫草子实体幼苗为3-4cm高，正值旺盛期孕育子囊孢子时，及时接入S2中用链霉菌制备异源高表达喷司他丁的液体种，具体地，每个三角瓶内均加入无菌水，加入量为异源高表达喷司他丁的液体种的3-4倍量，摇匀后再接入到蛹虫草子实体培养容器内，接入量为固体培养基内主料的1.2-1.4倍量，之后封口；S302：将蛹虫草子实体培养容器置于培养室内进行变温变光共生培养，培养时长为10-15天，每天通风一次，每次通风0.5-1小时。变温变光具体为：前7-12天内，每天以100-200Lx的光照强度光照12小时，温度为20-25℃；最后3天要求每天以500-1000Lx的光照强度光照12小时，保持恒温25℃；S303：当蛹虫草子实体培养基转为灰白色至黄褐色，蛹虫草子实体为4~6cm高并将要散发孢子时，及时采收；S304：加工保藏：将采收的蛹虫草子实体晾干表水，再用20%的干松针水配80%的60度白酒配置的液体均匀喷酒于蛹虫草子实体上，以60℃的温度将其烘干至含水量≤12%后封存。优选的，所有光照均由LED灯提供；优选的，所述蛹虫草母种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNO.5577，保藏时间2011年12月12日。该菌种为抗退化种专利号：ZL201210248399.6；优选的，所述链霉菌种购于中国医科学院药生所，编号为CPCC200004，抗肿瘤链霉菌也可用构巢曲霉或九洲虫草替代。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明生产的蛹虫草子实体，用高效液相色谱法定量检测，含喷司他丁≥0.1%，虫草素≥0.1%，而且非常稳定，储存10年内活性成分含量不变，是目前国内外双重活性成份最高水平表达的生物体，其成本最低，适于群众性生产，独具中国特色。

权利要求：1.一种高效抗癌蛹虫草及其生产方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：培养内源高表达虫草素的蛹虫草幼苗；S2：用链霉菌制备异源高表达喷司他丁的液体种；S3：异源与内源适时对接与共生培养；培养内源高表达虫草素的蛹虫草幼苗包括以下步骤：S101：配制固体培养基和营养液，所述固体培养基的制备方法是取小麦、莜麦、稻谷三种主料中的一种或者各取三分之一，装入培养容器内，装量为培养容器容积的6~24%，所述营养液的制备方法是马铃署200g、蔗糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、干松针20g、鲜蚕蛹（捣烂）100g加水煮溶取滤液，再加入腺嘌呤1g、甘氨酸16g加水至1000mL；S102：制备培养基，将固体培养基与营养液混匀分装于培养器中，120℃灭菌1.5小时；S103：将各培养器冷却至30℃以下时，在每个培养器内接入蛹虫草母种0.3-0.5cm2菌块3-5块，之后用聚丙烯塑料膜封口，将其置于培养室内变温变光培养35-42天，每日通风一次，每次0.5-1小时，准备异源对接。变温变光具体为：接种封口后前3-7天内闭光培养，温度为16-18℃；8-15天时光照强度为100-200Lx、温度为14-20℃，每天光照时间为12小时；长出子座后，每6小时转换一次光照强度，转换顺序依次为500Lx、1000Lx、1500Lx、2000Lx，温度为18-22℃；用链霉菌制备异源高表达喷司他丁的液体种包括以下步骤：S201：制备链霉菌液体培养基，所述链霉菌液体培养基的制备方法为水100ml、葡萄糖4g、麦芽粉10g、磷酸铵2g、氨基核糖0.3mg、PH值为6.9-7.2，煮溶取滤液，分装在多个三角瓶中，每个三角瓶内的装量为150mL500mL，封口，120℃下灭菌20min；S202：链霉菌种的静态和动态培养及保藏，具体地，在每个三角瓶内接入链霉菌母种0.5-1cm2的菌块2-3块，载于液面，之后将三角瓶置于恒温箱中静置培养48-72小时，恒温箱的温度为28-30℃，当白色孢子散发于液面时，将三角瓶置于摇瓶机上动态培养，温度保持在28-30℃，摇瓶机的转速为250rmin，光照强度为100-200Lx，培养时长为4-6天，形成异源高表达喷司他丁的液体种，将三角瓶置于冰箱内保存，保持温度为4-6℃，保藏时长为60小时；异源与内源适时对接与共生培养包括以下步骤：S301：在S103中35-42天的培养中，当蛹虫草子实体幼苗为3-4cm高，正值旺盛期孕育子囊孢子时，及时接入S2中用链霉菌制备异源高表达喷司他丁的液体种，具体地，每个三角瓶内均加入无菌水，加入量为异源高表达喷司他丁的液体种的3-4倍量，摇匀后再接入到蛹虫草子实体培养容器内，接入量为固体培养基内主料的1.2-1.4倍量，之后封口；S302：将蛹虫草子实体培养容器置于培养室内进行变温变光共生培养，培养时长为10-15天，每天通风一次，每次通风0.5-1小时。变温变光具体为：前7-12天内，每天以100-200Lx的光照强度光照12小时，温度为20-25℃；最后3天要求每天以500-1000Lx的光照强度光照12小时，保持恒温25℃；S303：当蛹虫草子实体培养基转为灰白色至黄褐色，蛹虫草子实体为4~6cm高并将要散发孢子时，及时采收；S304：加工保藏：将采收的蛹虫草子实体晾干表水，再用20%的干松针水配80%的60度白酒配置的液体均匀喷酒于蛹虫草子实体上，以60℃的温度将其烘干至含水量≤12%后封存。2.根据权利要求1所述的一种高效抗癌蛹虫草及其生产方法，其特征在于：所有光照均由LED灯提供。3.根据权利要求1所述的一种高效抗癌蛹虫草及其生产方法，其特征在于：所述蛹虫草母种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNO.5577，保藏时间2011年12月12日。该菌种为抗退化种专利号：ZL201210248399.6。4.根据权利要求1所述的一种高效抗癌蛹虫草及其生产方法，其特征在于：所述链霉菌种购于中国医科学院药生所，编号为CPCC200004，抗肿瘤链霉菌也可用构巢曲霉或九洲虫草替代。

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