申请/专利权人：河南工业大学

申请日：2018-12-20

公开（公告）日：2022-03-15

公开（公告）号：CN109867710B

主分类号：C07K7/06(20060101)

分类号：C07K7/06(20060101);C07K1/06(20060101);C07K1/04(20060101);A61P31/10(20060101);A61P31/04(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.03.15#授权;2019.07.05#实质审查的生效;2019.06.11#公开

摘要：本发明公开了一种新型广谱抗菌肽SAMP1‑A3及其制备方法。该抗菌肽的氨基酸序列为：NH2‑RKKKVLLI‑COOH。本发明的制备方法是采用氨基酸氮Fmoc保护的固相多肽合成方法。本发明克服了常见抗菌肽生物安全性差、易溶血或对哺乳动物细胞有毒性的缺点，是一种对非丝状真菌和细菌具有广谱抑制作用、不具有溶血性、对正常哺乳动物细胞没有毒性的新型抗菌肽。该多肽为临床抗真菌药物研究提供了一种新型先导物。

主权项：1.一种新型广谱抗菌肽，其特征在于：该抗菌肽氨基酸序列为NH2-RKKKVLLI-COOH。

全文数据：一种新型广谱抗菌肽SAMP1-A3及其制备方法技术领域本发明属于生物制剂，具体涉及一种新型抗菌肽及其制备方法。背景技术近年来，由于抗生素滥用，在感染类疾病中，分离出的耐药菌株，尤其耐药性真菌不断增多。超级耐药菌的出现，对细菌和真菌不易产生耐药性的临床新型抗生素的需求越来越迫切。因此，尽快研究和开发新型、高效、低毒、病原菌不易对其产生耐药性的抗菌药物具有重要意义。抗菌肽是动物机体天然免疫系统的重要组成部分。与传统抗生素主要是通过抑制某一生物合成途径（如细胞壁、蛋白质）发挥作用不同，大多数抗菌肽通过多途径、多靶点的作用机制抑制或杀死病原菌。抗菌肽独特的作用机制，致使微生物不易产生耐药性（FordeE,etal.Molecules,2015,201:1210-1227;王欢，等.细胞与分子免疫学杂志，2015，311:137-139）。因此，抗菌肽用来治疗人和动物的疾病在临床上有着极大潜力，可能是解决病原菌耐药性、药物毒副作用问题的最佳选择。目前，抗菌肽已成为多个领域的研究热点。利用基因工程技术表达多肽，表达产物不稳定，易被降解，纯化困难。化学合成30个氨基酸以上多肽，产物产量低、纯度低。因此，采用化学合成抗菌肽，为抗菌肽药物的开发奠定理论基础。发明内容本发明的目的是采用固相化学合成技术制备得到抗菌活性高、抗菌谱广、生物安全性高的新型抗菌肽SAMP1-A3。本发明的目的是通过以下技术方案实现的。利用固相化学合成技术，合成多肽SAMP1-A3。采用最小抑菌浓度法测定了SAMP1-A3抗菌谱；采用平板计数法研究了SAMP1-A3杀菌抑菌活性；通过溶血活性实验研究了SAMP1-A3的溶血活性；采用细胞毒性实验方法研究了SAMP1-A3对脐静脉血管内皮细胞生长的抑制作用。抗菌肽SAMP1-A3固相合成目前在国内外均未见报道。用此方法获得的抗菌肽SAMP1-A3有望为临床病原微生物感染提供良好的候选药物。本发明的抗菌肽SAMP1-A3具有以下优点：（1）具有广谱抗菌活性；（2）具有杀真菌和抑制细菌活性。（3）无溶血活性。（4）对正常哺乳动物细胞没有毒性。因此，本发明是一种广谱、高效、安全的杀念珠菌多肽，其制备未见报道。附图说明附图1为抗菌肽SAMP1-A3杀菌抑菌活性结果图。图1A为热带念珠菌；图1B为单增李斯特菌。附图2为抗菌肽SAMP1-A3溶血实验结果图。附图3为抗菌肽SAMP1-A3对人脐静脉内皮细胞HUVEC生长的影响图。图3A为对照；图3BSAMP1-A3浓度为78μgmL；图3CSAMP1-A3浓度为156μgmL；图3DSAMP1-A3浓度为234μgmL；图3ESAMP1-A3浓度为312μgmL。具体实施方式下面结合附图详细说明本发明的具体实施方式。实施例1抗菌肽SAMP1-A3的制备采用固相Fmoc法合成目的肽段，由C端至N端合成。将该多肽C端第一个Fmoc-Ile-OH的羧基活化后与树脂结合，脱去Fmoc-保护基，与第二个羧基活化的Fmoc-Leu-OH结合，再脱去Fmoc-保护基，循环重复，直至添加所有氨基酸。用切割液切割树脂上的肽，收集切割液，于离心管中吹干，冰乙醚洗沉淀2~3次，离心去上清，吹干沉淀。将得到的粗品，HPLC纯化。实施例2抗菌肽SAMP1-A3抗菌谱测定1）称量和溶解蛋白质。配制SAMP1-A3磷酸溶液，设第一列初始浓度500μgmL，终浓度为0.975μgmL。则需配制2mgmL的SAMP1-A3母液。用20mmolLpH6.0的磷酸钠缓冲液溶解SAMP1-A3，溶液用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。2）使用移液枪，在96孔板的各孔中分别加入100μL的20mmolLpH6.0的磷酸钠缓冲液，用于稀释SAMP1-A3。3）用移液枪吸取100μL2mgmLSAMP1-A3母液至96孔板第一列的每个孔中。4）反复吹吸板中第一列的溶液6~8次，混匀，不要溅起。5）从第一列吸取100μL加入到第二列，反复吹吸混合6~8次，然后再吸取100μL至第三列。重复此步骤至第十列。6）第十列吸取出的100μL丢弃，不要加入第11列，第11列为阴性对照孔。7）分别将100μL菌悬液按顺序加入96孔板的第1列至11列，并反复吹吸6~8次，混匀。注意不要将菌悬液添加到第12列。第12列为空白对照孔。8）静置孵育96孔板。如果是真菌需培养在30℃条件下48h；如果是细菌，则需培养在37℃条件下16h。9）每孔加入20μL5mgmLMTT溶液，继续培养4h。吸弃上清，加入100μL二甲基亚砜DMSO，37℃置20min，并不时摇动，待晶体溶解完全后，用酶标仪于490nm处测OD值。抑菌率（%）＝［（OD570样品–OD570（空白）］［OD570阴性–OD570（空白）］×100。MIC100定义为：使抑菌率达到99.9%时的SAMP1-A3最低浓度。每个实验重复三次。结果见表1。由结果可知，SAMP1-A3对新型隐球菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌活性最强，99.9%抑菌浓度为3.9μgmL；对大肠杆菌和热带念珠菌活性次之，99.9%抑制浓度为7.8μgmL。表1SAMP1-A3抗菌活性菌株MIC100μgmL热带念珠菌7.8白色念珠菌15.6克柔念珠菌15.6光滑念珠菌31.2近平滑念珠菌15.6新型隐球菌3.9大肠杆菌7.8铜绿假单胞菌62.5枯草芽孢杆菌3.9单增李斯特菌3.9金黄色葡萄球菌62.5结果表明，SAMP1-A3对热带念珠菌、新型隐球菌等为代表的真菌，对以枯草芽孢杆菌、单增李斯特氏菌为代表的革兰氏阳性细菌和以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性细菌都有较强抑制作用。实施例3抗菌肽SAMP1-A3杀菌抑菌活性测定通过测定抗菌肽作用后细菌真菌活菌数，检测SAMP1-A3杀菌抑菌活性。以热带念珠菌为真菌代表，以单增李斯特菌为细菌代表菌株。热带念珠菌：用SD液体培养基在28℃温度下，培养热带念珠菌至OD600≈0.6-0.8。将菌悬液接入含有1×MIC100SAMP1-A3的SD液体培养基中，至菌浓度约为1×105CFUmL。同时设不含SAMP1-A3的空白SD培养基作对照。28℃摇床中恒温培养，培养4h后，吸取100µL菌液，稀释后涂布于SD琼脂平板上，28℃过夜培养，进行菌落计数。单增李斯特菌：用TSB-YE液体培养基，在37℃温度下，培养单增李斯特菌至OD600≈0.6-0.8。接种菌悬液至含有1×MIC100SAMP1-A3的TSB-YE液体培养基中，至菌浓度约为1×105CFUmL。同时设不含SAMP1-A3的空白TSB-YE培养基作对照。37℃摇床中恒温培养，培养4h后吸取100µL菌液，稀释后涂布于LB琼脂平板上，37℃过夜培养，进行菌落计数。结果如图1所示。1×MIC100SAMP1-A3处理4小时后，热带念珠菌不能在SD平板上培养出单菌落，而单增李斯特菌能长出单菌落，说明SAMP1-A3对热带念珠菌具有杀菌活性，对单增李斯特菌具有抑杀活性。实施例4抗菌肽SAMP1-A3溶血性测定取无菌96孔板，吸取100μl2％的人红细胞混悬液加入到96孔板中。在各个孔中分别加入100μlSAMP1-A3溶液，使SAMP1-A3终浓度分别为250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、1.9、0.45和0.23μgmL，混合均匀，每个浓度重复三次。37℃孵育30min后，将各孔中的上清液取出转入到新的96孔微量滴定板中，使用微孔板酶标仪在570nm处测量样品的吸光度A。设未加SAMP1-A3的人红细胞混悬液为阴性对照（0%溶血），加入1%TritonX-100的人红细胞悬液为阳性对照100%溶血。计算溶血率。溶血率计算公式：溶血百分率%=[样品A570–阴性对照A570阳性对照A570–阴性对照A570]×100%结果如图2所示，5%溶血率时，SAMP1-A3浓度为140μgmL，远高于所测其对热带念珠菌、新型隐球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和单增李斯特杆菌的MIC100，分别是36倍和18倍。由结果可知，SAMP1-A3生物安全性高。实施例5抗菌肽SAMP1-A3对正常哺乳动物细胞毒性测定将人脐静脉内皮细胞HUVEC以5×104孔传代至24孔板中，在5%CO2和37℃的培养条件下，用含有10%FBS的MCDB培养液在恒温恒湿细胞培养箱中培养HUVEC细胞。待细胞长至融合状态后使用不同浓度（78μgmL，156μgmL，234μgmL，312μgmL）的SAMP1-A3处理细胞，24h后取出，将旧培养基吸出，用1×PBS洗一次，在倒置显微镜下观察细胞形态及死细胞数量变化。结果如图3所示。结果表明，在40倍的热带念珠菌MIC100浓度条件下，SAMP1-A3浓度下（312μgmL），仍测不出SAMP1-A3对脐静脉内皮细胞生长的影响。SAMP1-A3对哺乳动物细胞没有毒性作用。序列表河南工业大学一种新型广谱抗菌肽SAMP1-A3及其制备方法201811564473.92018-12-201SIPOSequenceListing1.018PRTArtificial1ArgLysLysLysValLeuLeuIle15

权利要求：1.一种新型广谱抗菌肽，其特征在于：该抗菌肽氨基酸序列为NH2-RKKKVLLI-COOH。2.权利要求1中所述抗菌肽的制备方法，其特征在于：采用常规固相多肽合成技术制备。3.权利要求2中的抗菌肽制备方法，其特征在于：在Fmoc保护系统的固相合成中，首先将RinkAmide-AMResin装在反应器中，20%哌啶溶液去保护；将C端第一个氨基酸Fmoc-Ile-OH与反应器中的去保护RinkAmide-AMResin混合，在HOBtDIC催化下，结合到固相载体上；按照给定的氨基酸序列，Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-LysBoc-OH、Fmoc-LysBoc-OH、Fmoc-LysBoc-OH、Fmoc-ArgPbf-OH依次偶联，由C端逐个向N端延伸，最后用切割液（87.5%TFA,2.5%1,3-dimethoxybenzene,2.5%triisopropylsilane,2.5%H2O,5%thioanisole）将多肽从固相载体上切下来。4.根据权利要求2所述的抗菌肽制备方法，其特征在于：可使用肽化学合成领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各种氨基酸残基，偶联剂可使用二异丙基碳二亚胺（DIC），二环己基碳二亚胺（DCC）进行直接偶联，或使用羟基苯骈三氮唑（HOBt）或7-氮杂羟基苯骈三唑（HOAt）活化氨基酸。

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