申请/专利权人：奧土择破利悟

申请日：2016-07-15

公开（公告）日：2022-06-14

公开（公告）号：CN108883149B

主分类号：A61K38/05

分类号：A61K38/05;A61K31/122;A61K31/13;A61K38/10;A61K38/16

优先权：["20150818 KR 10-2015-0116015"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.06.14#授权;2018.12.18#实质审查的生效;2018.11.23#公开

摘要：本发明的药物作用机制和关键技术在图1中总结。具体地，恶性的错误折叠的蛋白质例如突变的亨廷素或α‑突触核蛋白粘附在一起从而生长为寡聚聚集物①，②、原纤维聚集物③和最终地包涵体④。年轻的神经元细胞通过内质网分子伴侣例如BiP的N末端精氨酰化⑤产生大量的Nt‑Arg，然后精氨酰化BiPR‑BiP进入细胞质，并且结合错误折叠的蛋白质⑥。作为配体，R‑BiP的Nt‑Arg结合P62的ZZ结构域⑦，从而诱导P62⑧的结构激活，而p62的通常封闭的无活性形式变为其开放形式，因此暴露PB1和LC3结合结构域。基于由PB1结构域的寡聚⑨，p62结合错误折叠的蛋白质聚集物从而浓缩为自噬可降解的聚集物、即p62体⑩。然后，p62通过结合自噬体膜上突出的LC3来完成自噬靶向和溶酶体蛋白水解。在年轻的神经元细胞中，通过步骤发生的自噬蛋白水解强，因此细胞毒性的蛋白质聚集物①‑⑤不积累，但在老化的神经元细胞中，通过步骤发生的自噬蛋白水解弱化，因此蛋白聚集物①‑⑤积累，导致恶性循环。本发明尝试通过使用p62ZZ结构域的低质量配体人工激活p62来有效地移除亨廷素和α‑突触核蛋白聚集物等。具体地，通过步骤结合配体的p62促进p62‑R‑BiP‑错误折叠的蛋白质寡聚⑨和自噬聚集物形成⑩。此外，配体‑62缀合步骤作为自噬激活剂从而促进LC3合成、和LC3‑I向LC3‑II的转化等，由此促进自噬体的形成。

主权项：1.由下式6表示的化合物或其药物学可接受的盐在制备用于治疗或预防神经变性病的组合物中的用途：[式6]

全文数据：通过结合P62ZZ结构域的配体或精氨酰化BIP介导的自噬活性预防和治疗神经变性病技术领域[0001]本发明涉及通过调节由结合P62ZZ结构域的合成配体或精氨酰化BIParginylatedBIP，R-BiP介导的自噬活性的神经变性病的治疗方法。背景技术[0002]N端规则（N-endrule途径是蛋白质的单N末端残基（singleN-terminalresidue用作降解信号的蛋白水解系统（图1和2A端规则降解信号由以下例示：I型碱性残基，包括Arg、Lys、和His;和II型疏水残基，包括Phe、Leu、Trp、Tyr、和11e图2。这些N末端残基结合特定N-识别子N-recognin图3。本发明人首次发现或克隆了先前已知的N-识别子，即UBRl、UBR2、UBR4、和UBR5，并且发现它们利用UBR盒UBRbox作为底物识别结构域Tasaki等人2005,图3。本发明人还证实N-识别子的UBR盒结合I型N端规则配体例如N末端精氨酸Nt-Arg，从而识别底物并且将泛素链连接至底物。如本发明人证实，UBRl和UBR2具有在2型N端规则配体的结合中起重要作用的N结构域Nt-Trp、Nt-Phe、Nt-Tyr、Nt-Leu、和Nt-IleSriram等人，2011。从N-识别子和N端规则配体之间的结合产生的泛素化底物递送至降解所述泛素化底物的蛋白酶体。在该过程中，由于N-识别子提供靶向N端规则底物所需的大部分氢键，特定的N末端残基Nt-Arg、Nt-His、Nt-Lys、Nt-Trp、Nt-Phe、Nt-Tyr、Nt-Leu、和Nt-Ile是结合的必需决定因素，并且是配体的活性组分（图3c和3dSriram和Kwon,2010〇[0003]神经变性病是导致进行性神经元变性和或死亡的使人衰弱的病症debilitatingcondition。这些疾病根据主要症状和受影响的大脑区域来分类，并且包括阿尔茨海默病AD、帕金森病PD、亨廷顿舞蹈病HD、朊病毒病克-雅病、硬皮病、肌萎缩性侧索硬化症卢伽雷病LouGehrig’sdisease等。大多数已知的神经变性病是由蛋白质稳态proteostasis受损造成的致病蛋白聚集体aggregates的积累引起的。因此，神经变性病属于一组蛋白质错误折叠失调proteinmisfoldingdisorder，其最显著地包括由突变的亨廷素huntingtin蛋白的错误折叠引起的亨廷顿舞蹈病Williams等人，2008;Tsoi等人2012、由突变的α-突触核蛋白（alpha-synucleinprotein的错误折叠引起的帕金森病（Martin等人2011、由突变的肮病毒蛋白的错误折叠引起的克-雅病Griffith，1967、和由突变的SODl和TDP-34蛋白的错误折叠引起的卢伽雷病Andersen等人2011。所有这些错误折叠的蛋白质可快速地转化为对神经元有毒的聚集体。[0004]帕金森病PD是最有代表性的神经变性病之一，并且由多巴胺能神经元引起。PD症状包括休息性震颤restingtremor、强直、运动徐缓、和姿势不稳定。帕金森病的药物治疗可分为症状治疗和神经保护治疗。用于症状治疗的药物包括左旋多巴、多巴胺激动剂dopamineagonist、抗胆碱能剂anticholinergicagent、C0MT抑制剂、和金刚烧胺，而用于神经保护治疗的药物包括抗氧化剂和MO-B抑制剂。在这些中，最有效的药物是左旋多巴，其是多巴胺的直接前体，并且在脑中代谢为多巴胺。左旋多巴不仅由L-多巴脱羧酶、而且由儿茶酚-O-甲基转移酶COMT代谢。因此，左旋多巴与COMT抑制剂共同施用从而抑制左旋多巴的代谢并且延长左旋多巴在血液中的作用和持续时间。使用左旋多巴的多巴胺替代疗法已经在治疗具有帕金森病的患者中有效。然而，一旦治疗的持续时间超过5至10年，多数患者显示副作用例如锻炼和运动反应motorreaction中的波动fluctuation、自主功能障碍autonomicdysfunction、和姿势不稳定;并且不再观察到左旋多巴治疗的积极效果。[0005]四苯喹嗪TBZ是用于治疗亨廷顿舞蹈病的最常见药物。TBZ的作用的机制不是广泛公知的，但是已确认TBZ抑制突触前神经元中的囊泡单胺转运蛋白（vesicularmonoaminetransporter，导致单胺例如多巴胺、血清素、和皮质去甲肾上腺素的消耗。TBZ还在突触后神经元中充当对D2多巴胺受体的弱拮抗剂。用于治疗帕金森病的其他药物包括氯氮平和金刚烷胺。氯氮平是有效地减少运动失调的非典型的精神抑制剂。金刚烷胺用作NMDA受体拮抗剂，并且由于亨廷顿舞蹈病由多巴胺和谷氨酸受体的过度兴奋引起的事实，还用作亨廷顿舞蹈病的治疗。[0006]由于治疗基于不解决疾病的根本原因的症状疗法和神经保护疗法，帕金森病和亨廷顿舞蹈病的治疗就治疗效力和持久性而言有很多限制。因此，需要开发将预防或治愈疾病的根本原因的替代治疗方法。[0007]错误折叠的蛋白质在细胞中滞留，并且最终聚集体导致蛋白酶体介导的蛋白质降解的抑制，并且因此限制细胞功能并且引起细胞死亡。因此，需要由泛素-蛋白酶体系统UPS迅速地去除错误折叠的蛋白质（图4。在正常细胞中，UPS最小化错误折叠的蛋白质的细胞损伤。然而，在老化的神经元中，UPS变慢，从而错误折叠的蛋白质积累，导致聚集。在具有变性脑疾病例如亨廷顿舞蹈病和帕金森病的患者的神经元中，由于聚集的蛋白质过大而不能通过非常狭窄的内部蛋白酶体，特定突变蛋白聚集体防止它们由蛋白酶体降解。该发明中的核心技术是通过激活P62诱导的自噬来有效去除引起神经变性病的这些错误折叠的蛋白质聚集体。[0008]自噬是对于通过降解未折叠或受损的蛋白质和老化或损伤的细胞器来维持细胞稳态和遗传稳定性所必需的主要的细胞内蛋白质降解系统。巨自卩策macroautophagy以下称为自噬）负责降解细胞毒性的错误折叠的蛋白质（图4，所述错误折叠的蛋白质由多种选择性自受体识别并分类。p62SQSTMlSequestosome_l是结合泛素化的错误折叠的蛋白质导致它们共聚集并递送至自噬体的主要的选择性自噬受体（图4。？62介导的错误折叠蛋白质向自·体的转运需要p62的寡聚能力。通过寡聚，p62不仅包装其运载物cargo，还将运载物递送至自噬体形成位点用于自噬共降解。在这时，未折叠的蛋白质集中到一起从而减小体积，使得它们更易于通过自噬降解。PBl结构域通过未知的机制介导p62的自身寡聚（self-oligomerization。当自体结合溶酶体时，递送至自体的未折叠的蛋白质-p62缀合物可由溶酶体的酶类降解（图4。通过该机制，自噬可通过调节受损的蛋白质和细胞器的细胞内变化来维持细胞稳态。当自噬功能减弱时，错误折叠的蛋白质的积累增加，导致神经变性病。本发明的关键技术是提供激活细胞内自噬的方法。[0009]已积极地进行对于有效激活自噬从而治疗变性脑疾病的研究。mTOR是自噬抑制剂。使用mTOR抑制剂雷帕霉素激活自噬是最广泛使用的方法。在过表达APP的AD动物模型中，使用雷帕霉素治疗消除淀粉状蛋白PAb和tauCaccamo等人,2010;在过表达tau的Ad动物模型中，使用雷帕霉素治疗来消除tauRodriguez-Navarro等人，2010;并且在PD小鼠模型中，使用雷帕霉素治疗来消除过表达的α_突触核蛋白聚集物coagulumWebb等人，2003AD小鼠中，亨廷素聚集物通过使用雷帕霉素样物质CCI-779来有效地消除，改进动物认知行为Ravikumar等人，2002。然而，由于mTOR在多种细胞内途径包括NF-kB中起非常重要的作用，使用mTOR抑制剂作为自噬激活剂是受限的。[0010]存在使用自噬激活剂而不是mTOR抑制剂来诱导自噬的其他研究。具体地，在HD小鼠模型中，通过使用利美尼定（RiImenidine—种自噬的mTOR非依赖性激活剂mTORindependentactivator成功地消除亨廷素聚集物Rose等人,2010。[0011]在朊病毒病小鼠模型中，通过使用肌醇单磷酸酶抑制剂锂以激活自噬来成功地消除过表达的突变朊病毒PrPSc聚集物Heiseke等人，2009。此外，在PD小鼠模型中，通过使用锂来消除过表达的α-突触核蛋白聚集物Sarkar等人,2005;并且在肌萎缩性侧索硬化症ALS小鼠模型中，使用锂从脑移除过表达的突变S0D1G93A聚集物Feng等人，2008;Pizzasegola等人,2009。海藻糖一种植物提取物）已知不依赖于mTOR途径来激活自，并且用于在HD小鼠模型中从脑消除突变的亨廷素蛋白（Sarkar等人，2007。此外，海藻糖用于在PD小鼠模型中改善运动能力motorability和寿命Tanaka等人,2004，以及在不同的PD小鼠模型中消除过表达的A30P和A53T突变α-突触核蛋白（alpha-synuclein聚集物Sarkar等人，2007。漆树黄酮一种天然黄酮）已知为通过T0RC1和AMPK激活自噬，并且用于在动物模型中改善或减轻变性脑疾病的症状Maher等人，2011。然而，对使用这些其他自噬激活剂仍然存在限制，这是因为它们在细胞内信号转导系统中具有其他重要作用。[0012]如上所述，不存在不具有广泛副作用的治疗多数变性脑疾病例如亨廷顿舞蹈病的有效治疗剂。最常用作自噬激活剂的化合物mTOR抑制剂不足以作为治疗剂，这是因为mTOR在调节细胞中的整体基因表达中起广泛作用，因此抑制mTOR影响很多必需的生物途径而不仅仅是自噬。本发明提供通过激活在将错误折叠的蛋白质聚集物直接地递送至用于消除的自体中起重要作用的p62来消除作为变性脑疾病的致病因素causativefactor的错误折叠的蛋白质聚集物的技术。通过P62激活自噬不像抑制mTOR那样影响其他生物途径，因此减少潜在的副作用。[0013]本发明的药代动力学和关键技术在图1中总结。特别地，恶性的错误折叠的蛋白质例如突变的亨廷素和α-突触核蛋白凝聚，并且生长为寡聚聚集物①，②）、原纤维聚集物③和最终地包涵体④）。年轻的神经元通过囊泡分子伴侣（chaperone例如BiP的N末端精氨酰化⑤产生大量的Nt-Arg，然后精氨酰化BiPR-BiP易位至细胞质并且结合错误折叠的蛋白质（⑥）。作为配体，R-BiP的Nt-Arg结合P62ZZ结构域⑦），并且p62的通常无活性的封闭形式变为开放形式，导致结构激活⑧）。作为结果，暴露PBl和LC3结合结构域。PBl结构域促进P62寡聚⑨），导致p62与R-BiP和错误折叠的蛋白质一起聚集并且它们靶向自噬体形成位点⑩）从而诱导^：3的合成和^：3-1至LC3-II的转化。[0014]作为他们的研究和文献综述的结果，本发明人提出P62是自噬激活的首创靶标Cfirst-in-classtarget图1，⑧）。还没有在先研究提出将p62作为变性脑疾病中自激活或移除蛋白质聚集体的药物靶标。因此，本发明人要求开发靶向P62的新型治疗剂作为通过激活自噬来治疗神经变性病的方法的专利。[0015]在开发新型药物从而通过靶向P62作为激活自噬的方式来预防和治疗神经变性病的过程中，本发明人已证实P62ZZ结构域结合配体可通过上述机制激活自噬，导致突变的亨廷素和α-突触核蛋白聚集物的有效清除，证实用于治疗或预防神经变性病的药物组合物及其调节方法，导致本发明的完成。发明内容[0016]本发明的目的是提供用于预防和治疗神经变性病的药物组合物，其含有结合Ρ62ΖΖ结构域的配体作为活性成分。[0017]本发明的另一目的是提供用于预防和改善神经变性病的食品补充剂，其包括结合Ρ62ΖΖ结构域的配体作为活性成分。[0018]本发明的另一目的是提供诱导ρ62寡聚和结构激活（structuralactivationI;激活自噬（2;和消除错误折叠的蛋白质聚集物（3的方法，其包括对细胞施用结合P62ZZ结构域的配体的步骤。[0019]为了实现上述目的，本发明提供用于预防和治疗神经变性病的药物组合物，其包含结合P62ZZ结构域的配体作为活性成分。[0020]本发明还提供用于预防和改善神经变性病的食品补充剂，其包含结合P62ZZ结构域的配体作为活性成分。[0021]此外，本发明提供诱导p62寡聚和结构激活（1;增加P62-LC3结合2;增加P62向自噬体的转运3;激活自噬4;和消除错误折叠的蛋白质聚集物5的方法，其包括用结合P62ZZ结构域的配体处理细胞的步骤。[0022]发明的效果[0023]本发明涉及p62活性调节剂、自噬激活剂、和用于变性脑疾病的治疗剂，它们包括结合P62ZZ结构域的配体作为活性成分。本发明的结合P62ZZ结构域的配体包括X-Il肽X=Nt-Arg、Nt-Phe、Nt-Tyr、Nt-Trp、Arg_AlaRA、Trp_AlaWA、ZZ_L1、和ZZ-L2、和Nt-精氨酰化別？〇?^?。特别地4-11肽）作413、1^413、和1?^?的活性成分包括吡4找、财-Phe、Nt-Tyr、和Nt-Trp。因此，结合P62ZZ结构域的配体可有效地用作通过自噬调节来预防和治疗神经变性病的组合物的活性成分。附图说明[0024]参考附图最好地理解本发明的优选实施方案的应用，其中：[0025]图1是说明本发明提出的药物靶标和机制的图。[0026]图2是说明N末端蛋白水解途径的示意图。在该途径中，N末端残基例如Nt-Arg充当降解配体，并且可由N-识别子识别然后结合，导致底物的降解。在常规途径中，Nt-Arg诱导泛素化，由此促进底物向蛋白酶体的革巴向。在本发明中，发现Nt-Arg不仅结合p62来使其激活，还激活自噬途径。[0027]图3是说明N末端蛋白水解途径N端规则途径）中的N-识别子的结构和序列的图。a:说明UBR盒蛋白组UBR1-UBR7的一级结构的示意图。该组具有可结合Nt-Arg的UBR盒，其中已证实现1?1、1^1?2、1^1?4、和1^1?5结合财-六找。〇3:比较1^1?盒序列的图。（3，1:1^1?1的UBR盒的晶体结构。[0028]图4是说明泛素-蛋白酶体系统UPS、分子伴侣介导的自噬、和巨自噬如何相互合作从而移除错误折叠的蛋白质的示意图。[0029]图5是说明p62与N-配体例如N端规则新型N-识别子、即Nt-Arg和Nt-Trp的选择性结合的图。（a:为了识别新型N-识别子，研究在大鼠组织提取物中与装载有N-降解决定子N-degron的合成肽结合的蛋白质的类型的示意图。（b，c:通过用大鼠睾丸提取物进行的X肽拉下pulldown得到的那些蛋白质的银染色的结果。（d:用通过X肽拉下获得的那些蛋白质进行的iTRAQ同位素标记相对和绝对定量（Isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation的结果。（e-i:用通过X肽拉下获得的那些蛋白质进行的免疫印迹的结果。[0030]图6是说明通过使用Biacore分析来测量p62与Nt-ArgKd，40nM和Nt-PheKd，3.4μΜ的结合力的结果的图。[0031]图7是说明Ρ62通过其ZZ结构域结合N端规配体的图，并且还显示ZZ和UBR盒结构域的一级结构的比较。（a，c，e，g，i:说明ρ62的各种片段的示意图。（b，d，f，h，j:用这些ρ62片段进行的X肽拉下分析的结果。（I:Ρ62ΖΖ结构域和UBR盒的一级结构的比较的结果。[0032]图8是说明Arg-Ala诱导ρ62自身寡聚并且增加ρ62与LC3的结合的图。（a-c:ρ62自身寡聚的分析。为了研究当N-配体Arg-Ala结合Ρ62ΖΖ结构域时是否可诱导ρ62自身寡聚和聚集物形成，使用表达全长Ρ62的ΗΕΚ293细胞裂解物在非还原性SDS-PAGE中进行体外寡聚分析。（d:通过使用不能结合Arg-Il肽的Ρ62ΖΖ突变体进行的体外ρ62寡聚分析的结果。e:为了研究Ρ62ΡΒ1结构域是否参与ρ62聚集物的形成，评价D69A突变体的聚集能力。（f-h:进行ELISA从而研究Arg-Ala对p62与LC3的结合的作用。⑴：说明通过Nt-Arg与P62ZZ结构域的结合诱导P62的结构激活的示意图。[0033]图9是说明内质网分子伴侣的一级蛋白质序列的比较的图。这些蛋白质当在翻译后进入内质网时会失去信号肽。此时，N-配体暴露在成熟蛋白质中（表示为方框）。当错误折叠的蛋白质在细胞质中积累时，分子伴侣进入细胞质并且N末端精氨酰化。[0034]图10是说明通过N末端精氨酰化获得Nt-Arg作为N-配体的内质网蛋白的筛选的图。（a:说明N末端精氨酰化的示意图。当细胞通过错误折叠的蛋白质的积累而应激stressed时，分子伴侣进入细胞质，导致通过ATElR-转移酶的N末端精氨酰化。（b:用于测量R-BiP抗体的特异性和结合力而进行的肽结合分析的结果。（c:使用R-BiP抗体的斑点印迹分析dotblotassay。⑹：过表达ATElR-转移酶异构酶，然后通过使用上述R-BiP抗体证实R-BiP形成。（e:使用siRNA敲低knocked-downATEl时，证实R-BiP形成减少。[0035]图11是说明BiP、CRT、和PDI的N末端精氨酰化由ATEl介导的图。（a:通过表达Ub-X-BiP-flagX=Glu或Val检测精氨酰化。⑹：说明重组蛋白质Ub-X-Bip-mychis结构的形成的示意图。（c:通过使用上述结构证实Nt-Glul9上的X-BiP精氨酰化。（d:证实R-BiP不在ATEl敲除细胞中产生。（e:使用引起ER应激的毒胡萝卜素（thapsigargin，证实R-BiP不由内质网应激产生，而是由ATElR-转移酶引起的酶反应的产物。（f:通过使用细胞分级分离cellfractionation，证实上述生成的R-BiP大量移动至细胞质。（g:通过使用环己酰亚胺蛋白水解技术，证实相比于内质网中的非精氨酰化BiP，细胞质中的R-BiP相对地没有降解。⑹：研究由ATEl诱导的CRT和PDI的N末端精氨酰化。作为结果，证实当过表达ATEl同工酶时，产生R-CRT和R-PDI。[0036]图12是说明R-BiP的产生由细胞质中的外部DNA诱导的图。（a，b:当将双链DNAdsDNA引入细胞质时特异性地诱导R-BiP产生。（b，c:当dsDNA与R-BiP相似地引入细胞质时，还诱导R-CRT生成。（d:由dsDNA产生的R-BiP移动至细胞质，这通过细胞分级分离证实。e-g:R-BiP、R-CRT、和Ρ-ΗΙ作为对使用聚dA:dT模拟含有DNA的病原体病毒或细菌）的入侵DNA的先天性免疫应答的一部分而产生。（f:自噬也与上述过程一起激活。[0037]图13是说明R-BiP与p62—起转移至自噬体的图。（a:R-BiP转移至细胞质并在点状结构puncta中积累，这通过免疫组织化学染色证实。（b-d:R-BiP点状结构与P62点状结构a，c共定位colocalized并且还与LC3b_d共定位。（e:证实在小鼠胚胎心脏中BiP转移至LC3阳性自噬体。（f-h:当使用siRNA敲低ATEl或BiP时，R-BiP不迀移至自噬体。当敲低P62时，获得相似的结果。[0038]图14是说明当将R-BiP转移至自噬体时需要Nt-Arg的图。（a:说明根据细胞中Ub-X-BiP-GFP重组蛋白（X=Arg、Glu、或Val的过表达产生X-BiP-GFP的示意图。⑹：使用免疫染色研究重组蛋白向自噬体的迀移。（c=R-BiP转移至自噬体，但因为缺乏Nt-Arg,Val-BiPNt-Glul9由Val取代，从而不能用作精氨酰化的底物不转移至自噬体。（d:当将R-BiP的细胞内位置与LC3点状结构比较时，获得相似的结果。（e:在过表达消除大多数BiP并且保留19〜124个残基的Ub-X-BiPA图14a后，使用免疫染色检测X-BiPA%9细胞内位置。（f:当使用免疫染色检测X-BiP和LC3的细胞内位置时，获得相似的结果。[0039]图15是说明R-BiP的Nt-Arg直接结合P62ZZ结构域的图。（a，b:进行X肽拉下分析从而研究R-BiP的Nt-ARg是否可结合P62ZZ结构域。（c，d=R-BiP肽从细胞提取物拉下p62，但E-BiP或V-BiP肽则不。（e:说明制备以研究p62对于R-BiP的Nt-Arg的结合区域的p62片段的示意图。（f:用P62片段和R-BiP肽进行拉下分析。作为结果，R-BiP的Nt-Arg结合P62ZZ结构域。（g:仅切出（cutoutP62ZZ结构域，并且命名为p62-ZZ83-175-GST和p62-ZZD129A83-175。⑹：用P62片段进行GST拉下分析。（i:当在MEF细胞中同时地过表达p62-ZZ83-175-RFP和泛素-X-Bipl9-124-GFP时，Argl8-Bipl9-124与p62-ZZ83-175-RFP共定位，示出点状结构形成，而Vall9-Bipl9-124-GFP不与p62-ZZ83-175-RFP共定位，并且不示出点状结构形成。[0040]图16是说明R-BiP通过p62依赖性自噬作用分解的图。（a，b:构建在++和P62--细胞中过表达的Ub-X-BiPA-GST，然后是BiP降解分析。（c在自噬缺陷ATG5--细胞中，Ub-X-BiPA-GST的R-BiP不分解但积累。（d，e:用Ub-R-BiP-mychis进行环己酰亚胺蛋白水解量化分析。作为结果，证实R-BiP在细胞中高度稳定。[0041]图17是说明R-BiP由细胞质中的泛素化的蛋白质产生，然后结合细胞质中的错误折叠蛋白质并且将它们递送至自噬的图。（a:用使用聚dA:dT处理的HeLa细胞进行免疫印迹。作为结果，证实随着R-BiP的产生，泛素结合的细胞内蛋白质积累。（b:—些泛素化的细胞内蛋白质作为点状结构转移至P62,并与R-BiP和p62在该结构内共定位。（c:用各种化学物质处理细胞，然后免疫印迹从而研究R-BiP形成。作为结果，证实R-BiP形成由蛋白酶体抑制剂诱导。（d，e:当同时用在内质网中引起应激的蛋白酶体抑制剂和毒胡萝卜素处理细胞时，强烈地诱导R-BiP、R-CRT、和R-PDI的产生。（f:用Hsp90抑制剂格尔德霉素geldenamycin处理细胞，从而加速细胞中错误折叠的蛋白质的产生。作为结果，证实诱导R-BiP的产生。（g:作为未折叠的模型底物的YFP-CLl过表达，导致与R-BiP的直接缀合。（h，i:进行免疫荧光染色从而确认YFP-CLl转移至自噬泡并且R-BiP和p62在该结构中共定位。[0042]图18是说明小化合物ZZ-Ll和ZZ-L2增加p62寡聚并且结合LC3的图。（a，b:用ZZ-Ll处理过表达p62的细胞提取物，然后体外寡聚分析从而测量P62聚集物。（c:研究ZZ-Ll是否可以以与Arg-Ala相同的方式诱导P62的激活。作为结果，证实p62与LC3的结合由ZZ-Ll剂量依赖性地0、10、25、100、500、和100^1增加。（1-幻：进行免疫荧光共聚焦显微术从而研究ZZ-Ll和ZZ-L2是否可诱导p62点状结构形成。[0043]图19是说明ZZ-Ll和ZZ-L2是自噬激活剂的图。（a:通过免疫荧光染色证实ZZ配体不仅可加速HeLa细胞中的p62自噬点状结构形成还可加速LC3自噬点状结构形成，表明ZZ配体可作为自噬激活剂起作用。（b:进行蛋白质印迹从而研究ZZ-Ll和ZZ-L2对自噬的作用。c:LC3的增加和LC3-II的形成由ZZ化合物ZZ-Ll和ZZ-L2转染的si-对照诱导。然而，该效应通过敲低P62抑制。⑹：在使用++和p62-_细胞的相似实验中，证实在p62-_细胞中ZZ-15mM不作为自噬激活剂起作用。（e:用自噬抑制剂羟基氯喹HCQ处理经ZZ配体处理的细胞，然后免疫印迹从而量化LC3。（f:使用通过组合酸敏感的GFP和酸不敏感的RFP制备的RFP-GFP-LC3来稳定转染HeLa细胞，然后通过上述相同方式进行自噬动力学分析。（g:说明由ZZ配体激活的p62作为自噬激活剂起作用的示意图。[0044]图20是说明p62与ZZ配体组合不依赖于mTOR地激活自噬的图。（a:用ZZ-Ll处理HeLa细胞，然后进行环己酰亚胺蛋白水解分析。作为结果，证实p62降解由ZZ-Ll加速。（b，c:在不同处理时间用不同浓度下的ZZ配体和雷帕霉素处理HeLa细胞，从而比较它们之间作为自噬激活剂的作用和机制。然后，比较LC3生成和LC3-II转化。（d:说明雷帕霉素作为mTOR雷帕霉素的哺乳动物靶标抑制剂的示意图。当抑制mTOR时，激活自噬关键调节剂ULK，Beclin等），导致LC3合成和LC3-II转化的增加，导致自噬体产生的增加。（e:用ZZ配体或雷帕霉素处理HeLa细胞。然后，研究由mTOR调节的p70S6K的磷酸化。（f:进行免疫荧光分析从而研究ZZ配体是否可增加泛素化的细胞内蛋白质向自噬的迀移。作为结果，证实5mMZZ-Ll诱导泛素化的蛋白质至自噬泡的迀移。当对其施用自噬抑制剂羟基氯喹时，泛素化的蛋白质在自噬泡中积累。[0045]图21是说明突变的亨廷素蛋白聚集物由ZZ配体消除的图。（a:说明野生型亨廷素HDQ25-GFP和突变的亨廷素HDQ103-GFP;CAG重复103次）的示意图。⑹：用IOmMZZ-Ll或ImM雷帕霉素处理过表达亨廷素蛋白的细胞，然后斑点印迹分析从而研究细胞中的残余的亨廷素蛋白。（c:用IOmMZZ配体处理过表达HDQ103-GFP蛋白质聚集物的HeLa细胞，然后免疫荧光染色。（d:通过0.5%TritonX-100中的可溶级分和不可溶级分包括聚集物分开细胞，然后免疫印迹。作为结果，证实未折叠的亨廷素蛋白从ZZ-Ll处理的聚集物级分有效地去除。（e:用ZZ-L1、ZZ-L2、和雷帕霉素处理HeLa细胞，然后免疫印迹。（f:++和ATG5--细胞用IOmMZZ配体和ImM雷帕霉素处理，然后免疫印迹。[0046]图22是说明R-BiP和p62在由HDQ103-GFP亨廷素蛋白聚集物形成的包涵体中的共定位的图。（a，b，c:用IOmMZZ配体处理过表达HDQ103-GFP蛋白的HeLa细胞，然后免疫荧光染色。[0047]图23是说明ρ62-ΖΖ1、ρ62-ΖΖ2、和雷帕霉素的化学特征的比较的图。[0048]图24是说明ρ62-ΖΖ1在小鼠中的药代动力学特性的图。具体实施方式[0049]以下，详细地描述本发明。[0050]本发明提供通过使用结合P62ZZ结构域的配体作为活性成分来激活p62功能的方法。[0051]本发明还提供包含结合P62ZZ结构域的配体作为活性成分的自噬激活剂。[0052]本发明进一步提供通过使用结合P62ZZ结构域的配体作为活性成分来消除未折叠的蛋白质聚集物的方法。[0053]此外，本发明提供用于预防和治疗神经变性病的、含有结合P62ZZ结构域的配体作为活性成分的药物组合物。[0054]所述p62由SEQ.ID.NO:1表示的氨基酸序列组成。所述ZZ结构域的特征在于包含由SEQ.ID.NO:1表示的p62蛋白的氨基酸序列的128至163个残基。[0055]上述配体包含以下肽。在由下述SEQ.ID.NO:2〜NO:9表示的配体中，可直接地结合P62ZZ结构域的活性成分为Nt-Arg式I、Nt-Phe式2、Nt-Trp式3、或Nt-Tyr式4的N末端残基：[0056]SEQ.ID.N0:2：Arg-Ala；[0057]SEQ.ID.NO:3：Phe-Ala；[0058]SEQ.ID.NO:4:Trp-Ala;[0059]SEQ.ID.N0:5：Tyr-Ala；[0060]SEQ.ID.NO:6：Arg-Ile-Phe-Ser-Thr-Ile-Glu-Gly-Arg-Thr-Tyr-LysR-lI；[0061]SEQ.ID.NO:7：Trp-Ile-Phe-Ser-Thr-Ile-Glu-Gly-Arg-Thr-Tyr-Lysff-11；[0062]SEQ.ID.N0:8:BiP蛋白的N末端Glu19被精氨酰化R-BiP;和[0063]SEQ.ID.N0:9:精氨酰化BiP的N末端肽R-BiPD。[0064][式1][0065][0066][式2][0067][0068][式3][0069][0070][式4][0071][0072]上述配体含有下述由式5表示的化合物ρ62-ΖΖ1;2-3,4-双苄氧基）苄氨基）乙醇）、或由式6表示的化合物?62-222;1-3,4-双苄氧基苯氧基-3-异丙氨基丙醇）。特别地印62-222称为10314953。[0073][式5][0074][0075][式6][0076][0077]此外，上述配体结合P62ZZ结构域，并且激活p62蛋白的I3Bl结构域和LIR结构域，从而所述配体诱导P62寡聚和聚集物形成，并且还通过诱导p62聚集物形成来增加自噬体形成。通过上述过程，可有效地消除错误折叠的蛋白质（参见图1。[0078]本文的神经变性病选自由以下组成的组：莱姆包柔螺旋体病（Lymeborreliosis、致死性家族性失眠症Fatalfamilialinsomnia、克-雅病CJD、多发性硬化（MS、痴呆、阿尔茨海默病、癫痫、帕金森病、中风、亨廷顿舞蹈病、皮克病（Picksdisease、和肌萎缩性侧索硬化症ALS。[0079]在本发明的优选实施方案中，本发明人识别p62作为可结合Nt-Arg、Nt-Phe、Nt-Trp、和Nt-Tyr的N-识别子参见图5。特别地，证实p62对Nt-Arg具有优异的结合力参见图6。本发明人还证实P62ZZ结构域参与上述结合参见图7配体Arg-Ala诱导p62自身寡聚和聚集物形成参见图8d，并且还增加p62与LC3的结合参见图8f。通过N末端精氨酰化从获得Nt-Arg的内质网蛋白中识别出N末端精氨酰化BiPN-terminalarginylatedBiP,R-BiP、|丐网蛋白（calreticulin，R_CRT、和蛋白质二硫键异构酶proteindisulfideiS〇meraSe，R-roi参见图9。证实这些蛋白质的N末端精氨酰化由ATEl介导（参见图10。还确认细胞质中的外部DNA可诱导R-BiP产生参见图12，并且在此时R-BiP与p62共同递送至自噬体参见图13A-BiP以P62依赖方式由自噬作用降解然后泛素化参见图16。本发明人还识别与Nt-Trp结构上相似的小化合物ZZ-L1和ZZ-L2参见图18。此外，本发明人证实ZZ-Ll和ZZ-L2增加细胞内自噬体形成参见图19。证实ZZ化合物融合溶酶体和自噬体参见图20，并且通过自噬激活来移除错误折叠的蛋白质包括亨廷素聚集物参见图21和22〇[0080]因此，本发明的结合P62ZZ结构域的配体由于可诱导P62寡聚和聚集物形成，其可有效地用作用于通过使用所述配体调节自噬来预防和治疗神经变性病的药物组合物的活性成分。[0081]根据本发明的治疗剂或药物组合物可与常用的药物可接受的载体共同配制为合适的形式。所述〃药物可接受的〃在本文中表示生理地可接受的、并且不引起任何过敏反应或过敏样反应例如胃肠道失调和眩晕的组合物。药物可接受的载体由水、合适的油、盐水、葡萄糖水溶液和二醇类等例示，并且可另外地含有稳定剂和防腐剂。合适的稳定剂由抗氧化剂例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、和抗坏血酸例示。合适的防腐剂由苯扎氯铵、羟苯甲酸甲酯或羟苯甲酸丙酯、和氯丁醇例示。此外，本发明的组合物可含有多种添加剂例如悬浮剂、增溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、吸附抑制剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、PH调节剂、疼痛缓解剂painreliver、缓冲液、抗氧化剂等。包括上述例示的那些的适用于本发明的药物可接受的载体和制剂在雷明顿药物科学Remingtons’sPharmaceuticalScience最新版本中详细地描述。[0082]本发明的组合物可通过可由本领域技术人员进行的方法、通过使用药物可接受的载体和或赋形剂、以单位剂量的形式或在多剂量容器中配制。制剂可以为油或水溶性介质中的溶液、悬浮液或乳液，粉剂，颗粒剂，片剂或胶囊剂的形式。[0083]本发明的由式5或式6表示的化合物可用作药学可接受的盐的形式，其中所述盐优选由药学可接受的游离酸形成的酸加成盐。酸加成盐可从以下获得:无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚硝酸和亚磷酸，或无毒的有机酸例如脂肪族单二羧酸monodicarboxylate、苯基取代的链烧酸（alkanoate、轻基链烧酸、链烧二酸alkandioate、芳族酸和脂肪族芳族磺酸。药物上无毒的盐由以下例示:硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、氟化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐decanoate、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、癸酸盐caprate、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐dioate、己烷-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、羟基丁酸盐、甘醇酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐和扁桃酸盐mandelate。[0084]本发明中的酸加成盐可通过本领域技术人员公知的常规方法制备。例如，将式5或式6的化合物溶解于水混溶性的有机溶剂例如丙酮、甲醇、乙醇、或乙腈，向其中加入过量的有机酸或无机酸的酸水溶液从而诱导析出或结晶。然后，从混合物蒸发溶剂或过量的酸，随后通过干燥混合物来得到加成盐或吸滤析出的盐来得到所述加成盐。[0085]可通过使用碱制备药学可接受的金属盐。通过以下过程获得碱金属或碱土金属盐:将化合物溶解于过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液;过滤不溶性化合物盐；蒸发并且干燥剩余的溶液。此时，金属盐优选以钠、钾、或钙盐的药学上合适的形式制备。并且相应的银盐通过碱金属或碱土金属盐与合适的银盐例如:硝酸银的反应制备。[0086]本发明的药物组合物的给药方法可根据制剂容易地选择，并且可使用多种途径向哺乳动物例如牲畜和人类施用。例如，可以以粉剂、片剂、丸剂、颗粒剂、糖锭剂dragees、硬或软胶囊剂、液体剂、乳剂、悬浮剂、糖浆剂、酏剂、外用制剂、栓剂、和灭菌注射溶液剂的形式配制，并且可系统或局部、或者口服或胃肠外地施用。此时，可特别优选胃肠外给药。[0087]用于胃肠外给药的制剂为灭菌水溶液剂、水不溶性赋形剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。除了活性化合物或多种活性化合物以外，水不溶性赋形剂和悬浮剂可含有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射的酯如油酸乙酯（ethylolate等。除了活性化合物或多种活性化合物以外，栓剂可含有witepsol、聚乙二醇macrogol、吐温61、可可脂、月桂酸甘油酯、甘油、明胶等。[0088]用于口服给药的固体制剂为片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂和胶囊剂。这些固体制剂通过将本发明的由式5或式6表示的化合物与一种或多种合适的赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等混合来制备。除了简单的赋形剂以外，可使用润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石等。用于口服给药的液体制剂为悬浮液、溶液、乳液和糖浆，并且除了通常使用的简单的稀释剂例如水和液体石蜡以外，上述制剂可含有多种赋形剂例如湿润剂、添味剂、芳香剂和防腐剂。[0089]本发明的药物组合物的有效剂量可根据体重、年龄、性别、健康条件、饮食、给药频率、给药方法、排泄和疾病的严重性来确定。在口服给药的情况下，对于成人60kg可以以每天Ing-1Omg、更优选每天Img-1g施用药物组合物。对本领域技术人员明显的是，可加减剂量，这是由于剂量可根据各种条件改变，并且因此剂量不可通过任何方式限制本发明的范围。[0090]给药频率为一天一次或在期望的范围内的一天几次，并且不特别限制给药时段。[0091]本发明还提供用于预防和改善神经变性病的健康功能性食品补充剂，其含有结合P62ZZ结构域的配体作为活性成分。[0092]上述配体选自由以下组成的组:Arg-AlaSEQ.ID.NO:2、Phe-AlaSEQ.ID.NO:3、Trp-AlaSEQ·ID·NO:4、Tyr-AlaSEQ.ID.N0:5、R-IlSEQ.ID.NO:6、W-IlSEQ.ID.N0:7、R-BiPSEQ.ID.N0:8、和R-BiI3DSEQ.ID.N0:9。上述配体的活性成分为选自由Nt-Arg式I、Nt-Phe式2、Nt-Trp式3、和Nt-Tyr式4组成的组的N末端残基。[0093]上述配体为ρ62ΖΖ1式5或p62-ZZ2式6:NCI314953。[0094]可含有本发明的化合物的食品类型不受限制，并且可包括几乎每一种适用于生产健康食品的食品。[0095]本发明的化合物可按原样加入或根据常规方法与其他食品组分混合。活性成分的混合比可根据使用的目的预防或健康增强来调节。通常，为了生产健康食品或饮料，优选以0.1-90质量份加入本发明的化合物。然而，如果健康和卫生或调节健康条件需要长期给药，含量可以比上述更低，但是由于已证明化合物是非常安全的，也可接受更高的含量。[0096]本发明的健康饮料用组合物，除了上述化合物以外，可像其他饮料一样另外包括多种香料或天然碳水化合物等。上述天然碳水化合物可为以下的一种:单糖例如葡萄糖和果糖，二糖例如麦芽糖和蔗糖，多糖例如糊精和环糊精，以及糖醇例如木糖醇、山梨糖醇和赤藓醇。此外，可包括天然的甜味剂奇异果甜蛋白（thaumatin，甜叶菊stevia提取物例如甜叶菊苷A、甘草甜素等和合成的甜味剂糖精、阿斯巴甜等作为甜味剂。天然的碳水化合物的含量优选以IOOml的组合物计为l-20g、并且更优选5-10g。[0097]除了上述成分以外，本发明的健康食品组合物可包括多种营养素、维生素、矿物质电解质）、包括天然香料和合成香料的香料、着色剂和膨胀剂奶酪、巧克力等）、果胶酸和其盐、褐藻酸和其盐、有机酸、保护性胶态增粘剂protectivecolloidalviscosifier、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于加入苏打的碳酸化剂carbonator等。本发明的健康食品组合物还可包括可添加至天然果汁、水果饮料和或蔬菜饮料中的果肉。[0098]所有上述成分可单独或一起添加。那些成分的混合比事实上不重要，但通常每种可以以相对于100重量份的本发明化合物为〇.1-20重量份加入。[0099]因此，本发明的结合P62ZZ结构域的配体由于可诱导p62寡聚和聚集物形成，其可有效地用作用于通过使用所述配体调节自噬来预防和改善神经变性病的健康食品补充剂的活性成分。[0100]此外，本发明提供包含使用结合P62ZZ结构域的配体或p62蛋白来处理细胞的步骤的方法，用于通过配体结合P62ZZ结构域来诱导p62寡聚；用于增加p62活性，包括增加p62和LC3之间的结合的步骤;用于通过配体结合P62ZZ结构域来增加p62向自噬体的转运;用于通过配体结合P62ZZ结构域来诱导自噬的激活；用于通过配体结合P62ZZ结构域来将未折叠的蛋白质聚集物递送至自噬体;和用于通过使用结合P62ZZ结构域的配体激活自噬来增加溶酶体介导的错误折叠蛋白质聚集物的降解。[0101]因此，本发明的结合P62ZZ结构域的配体由于可诱导p62寡聚和聚集物形成，其可通过使用所述配体调节自噬来有效地用于预防和治疗神经变性病。[0102]实施例[0103]如以下实施例所示，本发明的实际和目前优选的实施方案是说明性的。[0104]然而，将理解的是，本领域技术人员考虑到本公开可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。[0105]实施例I:p62鉴定为新型N-识别子[0106]为了鉴定结合N-降解决定子的新型N-识别子，通过将N-降解决定子与N末端连接来合成肽。然后，研究可在大鼠组织提取物中结合合成的肽的蛋白质种类。[0107]特别地，进行X肽拉下分析和质谱相关的iTRAQ同位素标记相对和绝对定量）。作为N端规则相互作用蛋白，使用大鼠睾丸提取物，并且还使用固定在链霉亲和素珠上的生物素标记的X肽R11序列:RIFSTIEGRTY1型）、F11序列FIFSTIEGRTY2型）、和Vll稳定的对照）（VIFSTIEGRTY图5a和d。与X肽连接的10聚体接头（10-merlinker源自新培斯病毒Sindbisvirus聚合酶nsP4、S卩N端规则的底物。混合物用5XPBS稀释，然后在4°C下过夜培养。通过使用各X肽拉下的蛋白质使用不同的荧光素通过iTRAQ标记。基于Mascot评分，鉴定了约200种蛋白质，其中包括参与N端规则途径的哺乳动物UBR盒E3家族，UBRl、UBR2、UBR4、和UBR5图5b和c。[0108]在X肽拉下分析后，通过免疫印迹确认结果（图5e-iWBRl在Rll和Fll拉下分析两者中观察到。仅在Fl1拉下分析中确认UBR2。在Rl1分析中确认UBR4和UBR5。作为Vl1稳定的对照拉下分析的结果，UBR蛋白不析出。除了UBRE3连接酶以外，通过质谱在Rll沉淀样品中识别的蛋白质为sequestosomeIp62蛋白。[0109]如图5c所示，银染色的凝胶中的Rll拉下样品中的62kDa附近的区域中观察到强的条带，但未在阴性对照Vll拉下样品中观察到该条带。根据质谱的结果，证实条带为P62sqstml以下称为p62图5c。从上述实验的结果，证实p62为新型N-识别子。[0110]实施例2:p62作为能够结合财^作、财41^、财-1'印、和财174勺1识别子的鉴定[0111]为了更清楚地识别实施例〈1-1中的P62蛋白，进行以下实验。[0112]特别地，通过使用由对应于人类p62的氨基酸1-440的全长重组蛋白产生的小鼠单克隆p62抗体（1:500，ab56416，Abcam，Cambridge，UK来进行蛋白质印迹。作为结果，如图5d所示，体外转录和翻译的P62示出特异性地对Rll肽的强结合亲和性，但对于Fll肽的弱结合亲和性，以及对Vll肽没有显著结合（图5d。基于用于本文的实验的浓度，Rll肽可以以至少40%的效率析出p62,而Fll肽显示5%的效率。由二肽竞争分析验证结果。在结合p62的方面，RA肽Arg-Ala与Rll肽最有效地竞争。下一个有效的竞争者是另一种1型N端规则肽HAHis-Ala图5h和i。在2型肽中，WATrp-Ala有效，但FAPhe-Ala无效。从与AR的竞争分析的结果，证实RA、HA和WA对N端规则是特异性的。上述结果表明p62可结合1型和2型N端规则肽两者。[0113]为了直接地测定p62与N末端残基的结合特异性，通过使用X肽拉下技术来研究p62与具有多种^^末端残基的肽的结合。[0114]作为结果，如图5h所示，证实p62可结合三种类型的N端规则N末端残基RlI、H11、和Kl1图5h。还证实p62较强地结合Rl1肽，适度地结合Kl1，并且较弱地结合Hl1。内源p62还结合四种N端规则N末端残基的三种，S卩FlUWll和Yll，但不是Lll图5h^rg⑻、His⑹和LysK具有正侧链positivesidechain，而Phe⑻、TrpW和Tyr⑺具有芳香族侧链。从结合p62的氨基酸的特征，证实p62可为带正电的或优选的芳香族侧链。p62不优选具有疏水性侧链例如ValV、LeuL和Gly⑹的氨基酸和具有带负电的侧链例如Asp⑼的氨基酸。上述结果表明p62选择性地结合Nt-Arg、Nt-Trp、Nt-Phe、和Nt-Tyr。[0115]实施例3:p62与Nt-Arg和Nt-Phe的结合力的评价[0116]进行以下实验，从而测定p62与Nt-Arg和Nt-Phe的结合常数。[0117]特别地，p62-D3-GST在大肠杆菌E.CoIi中表达，然后以50%纯度纯化。生物素标记的X肽在链霉亲和素涂覆的芯片上使用表面等离子体共振生物传感器Biacore固定，然后将P62-D3-GST蛋白插入固定的肽。[0118]作为结果，如图6所示，p62-D3-GST较强地结合Rl1肽，较弱地结合Fl1，并且不结合Vll图6。1?11和Fll的Kd值分别为44nM和3.4μΜ。特别地，p62与Nt-Arg的结合力比含有UBR盒的N-识别子Kd，3.2yM高约50倍。结果表明p62是新型的药物靶标。[0119]实施例4:Nt-Arg和Nt-Phe与P62ZZ结构域的直接结合[0120]为了研究Nt-Arg可结合的p62的位置，构建一系列的p62缺失突变体Dl〜D8，并且如实施例1中所述的相同方式通过X肽拉下分析验证它们与Rll和Wll的结合。[0121]特别地，Dl〜D4为一系列p62C末端缺失突变体。D5〜D8为一系列p62N末端缺失突变体。Nt-Arg和Nt-Trp结合含有ZZ结构域的02、03、04、和05，但不结合不含有22结构域的D1、D6、和D7图7a-b。为了更精确地研究p62与Nt-Arg和Nt-Trp的结合区域，缺失突变体在P62D3C末端产生，其与N端规则N末端的结合通过X肽拉下分析来检测（图7c。在总共9种p62缺失突变体中，CDl〜⑶6与Nt-Arg和Nt-Trp结合（图7d。没有两个组氨酸残基ZZ结构域的锌指基元结构zincfingermotifstructure的来自⑶7的突变体也不与之结合。通过X肽拉下分析测定N末端的最小ZZ结构域（图7e。在从全长p62的I3Bl区域开始至ZZ结构域的中间区域的区域中，构建6个N末端缺失突变体。ND-1、ND-2、ND-3、和ND-4结合Nt-Arg，但ND-5和ND-6不与之结合（图7f。勵-5不含有半胱氨酸残基C128和天冬氨酸D129，非典型的双核Zn指Zn-finger的元件在UBR盒中是保守的。没有ZZ结构域的突变p62不结合Nt-Arg图7g-h。仅含有ZZ结构域#83-175的片段可结合Nt-Arg，但D129A突变体不能与之结合图7i-j。上述结果表明Nt-Arg和Nt-Trp结合P62ZZ结构域。[0122]为了研究Nt-Arg和Nt-Trp与p62的结合是否是由于N端规则，通过用丙氨酸替换p621-440的D129、D142_145、D147_149、D151_154、H160_163和E177来构建6个点突变，然后是X肽拉下分析。ZZ结构域突变体不能结合Nt-Arg和Nt-Trp图7k。上述结果表明ZZ结构域和UBR盒通过N端规则结合Nt-Arg和Nt-Trp韩国生命工学研究院和首尔大学校产学协力团[0204]〈120使用结合P62ZZ结构域的化合物或精氨酰化BiP的自噬刺激用于预防和治疗神经变性病[0205]2016FP0-06-012_PCT[0206]KR10-2015-0116015[0207]2015-08-18[0208]9[0209]KoPatentIn2.0[0210]1[0211]〈211M40[0212]PRT[0213]〈213智人（Homosapiens[0214]1[0243]2[0244]2[0245]PRT[0246]〈213人工序列[0247][0248]ArgAla肽[0249]2[0250]ArgAla[0251]I[0252]3[0253]2[0254]PRT[0255]〈213〉人工序列[0256][0257]PheAla肽[0258]3[0259]PheAla[0260]I[0261]4[0262]2[0263]PRT[0264]〈213人工序列[0265][0266]TrpAla肽[0267]〈4004[0268]TrpAla[0269]I[0270]5[0271]2[0272]PRT[0273]〈213人工序列[0274][0275]TyrAla肽[0276]5[0277]TyrAla[0278]1[0279]6[0280]12[0281]PRT[0282]〈213人工序列[0283][0284]R_11肽[0285]6[0286]ArgHePheSerThrHeGluGlyArgThrTyrLys1510[0287]7[0288]12[0289]PRT[0290]〈213人工序列[0291][0292]W_11肽[0293]7[0294]TrpHePheSerThrHeGluGlyArgThrTyrLys1510[0295]8[0296]636[0297]PRT[0298]〈213人工序列[0299][0300]R-Bip肽[0301]8[0342]9[0343]637[0344]PRT[0345]〈213人工序列[0346][0347]R-BipD肽[0348]9

权利要求：1.一种用于神经变性病的预防和治疗的药物组合物，其包含结合P62ZZ结构域的配体作为活性成分。2.根据权利要求1所述的用于神经变性病的预防和治疗的药物组合物，其中所述p62蛋白包含由SEQ.ID.NO:1表示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的用于神经变性病的预防和治疗的药物组合物，其中所述ZZ结构域含有由SEQ.ID.NO:1表示的所述p62蛋白的氨基酸序列的128至163个残基。4.根据权利要求1所述的用于神经变性病的预防和治疗的药物组合物，其中所述配体选自由Arg-AlaSEQ.ID.N0:2、Phe-AlaSEQ.ID.N0:3、Trp-AlaSEQ.ID.N0:4、Tyr-AlaSEQ.ID.N0:5、R-11SEQ.ID.N0:6、W-11SEQ.ID.N0:7、R-BiPSEQ.ID.N0:8、和R-BiPDSEQ.ID.NO:9组成的组。5.根据权利要求4所述的用于神经变性病的预防和治疗的药物组合物，其中所述配体的活性成分为选自由Nt-Arg式I、Nt-Phe式2、Nt-Trp式3、和Nt-Tyr式4组成的组的N末端残基。6.根据权利要求1-6任一项所述的用于神经变性病的预防和治疗的药物组合物，其中所述配体为P62-ZZ1式5或p62-ZZ2式6;NCI314953:7.根据权利要求1所述的用于神经变性病的预防和治疗的药物组合物，其中所述神经变性病选自由阿尔茨海默病AD、帕金森病PD、亨廷顿舞蹈病HD、朊病毒病、多发性硬化MS、莱姆包柔螺旋体病、致死性家族性失眠症、克-雅病CJD、痴呆、癫痫、中风、皮克病、和肌萎缩性侧索硬化症ALS;卢伽雷病组成的组。8.根据权利要求1所述的用于神经变性病的预防和治疗的药物组合物，其中所述配体结合P62ZZ结构域从而激活p62蛋白的I3Bl结构域和LlR结构域，结果诱导p62寡聚和聚集物形成。9.根据权利要求1所述的用于神经变性病的预防和治疗的药物组合物，其中所述配体通过诱导P62聚集物形成来形成自噬体。10.—种用于神经变性病的预防和改善的健康食品补充剂，其包含结合P62ZZ结构域的配体作为活性成分。11.根据权利要求10所述的用于神经变性病的预防和改善的健康食品补充剂，其中所述配体选自由Arg-AlaSEQ.ID.NO:2、Phe-AlaSEQ.ID.NO:3、Trp-AlaSEQ.ID.NO:4、Tyr-AlaSEQ.ID.N0:5、R-11SEQ.ID.N0:6、W-11SEQ.ID.N0:7、R-BiPSEQ.ID.N0:8、和R-BiPDSEQ.ID.NO:9组成的组。12.根据权利要求11所述的用于神经变性病的预防和改善的健康食品补充剂，其中所述配体的活性成分为选自由Nt-Arg式I、Nt-Phe式2、Nt-Trp式3、和Nt-Tyr式4组成的组的N末端残基。13.根据权利要求11所述的用于神经变性病的预防和改善的健康食品补充剂，其中所述配体为P62-ZZ1式5或p62-ZZ2式6;NCI314953:14.根据权利要求11所述的用于神经变性病的预防和改善的健康食品补充剂，其中所述神经变性病选自由阿尔茨海默病AD、帕金森病PD、亨廷顿舞蹈病HD、朊病毒病、多发性硬化MS、莱姆包柔螺旋体病、致死性家族性失眠症、克-雅病CJD、痴呆、癫痫、中风、皮克病、和肌萎缩性侧索硬化症ALS;卢伽雷病组成的组。15.—种通过配体结合P62ZZ结构域从而诱导p62的寡聚然后增加p62和LC3之间的结合来增加p62活性的方法，其包括对细胞或p62蛋白施用结合P62ZZ结构域的所述配体的步骤。16.—种通过配体结合P62ZZ结构域来增加p62向自噬体的转运的方法，其包括用结合P62ZZ结构域或p62蛋白的所述配体处理细胞的步骤。17.—种通过配体结合P62ZZ结构域来激活自噬的方法，其包括用结合P62ZZ结构域或p62蛋白的配体处理细胞的步骤。18.—种通过配体结合P62ZZ结构域来激活错误折叠的蛋白质聚集物转移至自噬体的过程的方法，其包括用结合P62ZZ结构域或p62蛋白的配体处理细胞的步骤。19.一种通过由配体结合P62ZZ结构域的自噬激活来促进错误折叠的蛋白质聚集物通过溶酶体降解的方法，其包括用结合P62ZZ结构域或p62蛋白的配体处理细胞的步骤。20.—种神经变性病的预防和治疗方法，其包括在受试者中施用结合P62ZZ结构域的配体的步骤。21.—种结合P62ZZ结构域的配体用于神经变性病的预防和治疗的组合物的用途。22.—种结合P62ZZ结构域的配体用于神经变性病的预防和改善的健康食品补充剂的用途。

百度查询： 奧土择破利悟 通过结合P62ZZ结构域的配体或精氨酰化BIP介导的自噬活性预防和治疗神经变性病

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