申请/专利权人：先锋国际良种公司

申请日：2016-09-29

公开（公告）日：2022-07-26

公开（公告）号：CN108291236B

主分类号：C12N15/82

分类号：C12N15/82;C12N9/10

优先权：["20150930 US 62/234818"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.07.26#授权;2018.08.10#实质审查的生效;2018.07.17#公开

摘要：提供了包含多核苷酸和具有EPSP5‑烯醇丙酮莽草酸‑3‑磷酸合酶EPSPS活性的多肽的组合物和方法。在具体实施例中，序列具有改进的特性，例如但不限于在抑制剂草甘膦的存在下，改进的催化能力。进一步提供了具有EPSPS序列的核酸构建体、植物、植物细胞、外植体、种子和籽粒。提供了采用EPSPS序列的不同方法。此类方法包括用于产生草甘膦耐受性植物、植物细胞、外植体或种子的方法，以及在含有采用本文公开的植物和或种子的作物的田地中，控制杂草的方法。

主权项：1.一种多核苷酸，其编码植物EPSP合酶（EPSPS）多肽，其中该植物EPSPS多肽选自SEQIDNOs:5、10、11、12、18、19和20。

全文数据：植物EPSP合酶和使用方法[0001]相关申请的交叉引用[0002]本申请要求于2015年9月30日提交的美国临时申请号62234,818的权益，将其全部内容通过引用特此结合。发明领域[0003]本领域涉及分子生物学的领域。更具体地，它涉及赋予对草甘膦的耐受性的序列。[0004]以电子方式提交的序歹U表的引用[0005]该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“88250卟：1'_5691161^61^8^即_5了2541€’，创建于2016年9月19日，且具有96千字节大小，并与本说明书同时提交。包括在该ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。背景技术[0006]EPSP5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶是催化磷酸烯醇丙酮酸和3-磷酸莽草酸转化为磷酸和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸EPSP的酶，并且它参与芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸的生物合成。草甘膦世界上最畅销的除草剂起到磷酸烯醇丙酮酸的竞争性抑制剂的作用。[0007]已经通过将草甘膦不敏感的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS酶引入植物，产生了草甘膦耐受性作物。在一个实例中，玉米事件NK603使用来自农杆菌属物种菌株CP4的EPSPS。该酶对于草甘膦的抑制是高度不敏感的，同时它保留了与天然植物酶相似的催化效率Sikorski和Gruys.1997.Acc.Chem.Res.[化学研究述评]30:2-8。在另一实例中，玉米事件GA21使用双重突变型玉米EPSPS，其中在位置103的苏氨酸被改变为异亮氨酸，并且在位置107的脯氨酸被改变为丝氨酸。[0008]具有提供对草甘膦的充分耐受性和维持代谢流的正常速率的催化能力的动力学特性的植物EPSP合酶是令人希望的。发明内容[0009]本文提供了植物EPSP合酶本文称为EPSPS和编码其的多核苷酸。还提供了用于产生对植物EPSPS酶耐受的草甘膦耐受性植物的方法。[0010]本文提供了编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，这些EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个或多个氨基酸突变，该组由以下组成：（aA2R、（bA4W、（cH54M、⑹A72Q、（eK84R、（fL98C、（gK173R、⑹I208L、（iK243E、（jT279A、⑹E302S、（IT361S、（mE391P、nE391G、⑹D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS多肽包含与SEQIDNO:2具有至少90%同一性的序列。在一些实施例中，这些多核苷酸编码植物EPSPS多肽，这些植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个氨基酸突变，该组由以下组成：（aA2R、（bA4W、（cH54M、（dA72Q、（eK84R、（fL98C、（gK173R、⑹I208L、（iK243E、（jT279A、⑹E302S、⑴T361S、（mE391P、（nE391G、〇D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS多肽包含与SEQIDN0:2具有至少90%同一性的序列。[0011]在其他实施例中，该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含:A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。仍在其他实施例中，该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q。仍在其他实施例中，该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。仍在其他实施例中，该多核苷酸编码SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、或SEQIDN0:6中列出的植物EPSPS多肽。[0012]还提供的是包含本文公开的多核苷酸的重组DNA构建体;在其基因组中包含本文公开的多核苷酸或包含此类多核苷酸的重组DNA构建体的植物细胞；以及在其基因组中包含本文公开的多核苷酸或包含此类多核苷酸的重组DNA构建体的植物。在一些实施例中，该植物细胞是玉米细胞。在一些实施例中，该植物是玉米。[0013]本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法。这些方法包括在可再生植物细胞中表达包含可操作地连接到至少一种调节序列的多核苷酸的重组DNA构建体，其中该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：（aA2R、（bA4W、（cH54M、（dA72Q、（eK84R、（fL98C、（gK173R、（hI208L、⑴K243E、（jT279A、（kE302S、（IT361S、（mE391P、（nE391G、（oD402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDN0:l中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS多肽包含与SEQIDN0:2具有至少90%同一性的序列；并且产生草甘膦耐受性植物，该草甘膦耐受性植物在其基因组中包含该重组DNA构建体。在一些实施例中，这些方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个、至少三个、或至少四个氨基酸突变，该组由以下组成：（aA2R、（bA4W、（cH54M、（dA72Q、（eK84R、（fL98C、（gK173R、⑹I208L、（iK243E、（jT279A、⑹E302S、（IT361S、（mE391P、nE391G、⑹D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQIDNO:I中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS多肽包含与SEQIDNO:2具有至少90%同一性的序列。[0014]在其他实施例中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA，该重组DNA包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含:A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。仍在其他实施例中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA，该重组DNA包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含:A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q。仍在其他实施例中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA，该重组DNA包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含:A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。仍在其他实施例中，该方法包括在植物细胞中表达包含编码SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、或SEQIDN0:6中列出的植物EPSPS多肽的多核苷酸的重组DNA。[0015]本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中修饰内源植物EPSPS基因（在植物细胞中）以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：（aA2R、（bA4W、（cH54M、（dA72Q、（eK84R、（fL98C、（gK173R、⑹I208L、（iK243E、（jT279A、⑹E302S、⑴T361S、（mE391P、（nE391G、〇D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:1中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDNO:2具有至少90%同一性的序列；并且从该植物细胞生长草甘膦耐受性植物。在一些实施例中，修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含G102A和选自下组的氨基酸突变中的至少两个、至少三个、或至少四个，该组由以下组成：（aA2R、（bA4W、（cH54M、（dA72Q、（eK84R、（fL98C、（gK173R、⑹I208L、（iK243E、（jT279A、（kE302S、（IT361S、（mE391P、（nE391G、（oD402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和（tF442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQIDNO:1中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDNO:2具有至少90%同一性的序列。[0016]在其他实施例中，修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含：A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。仍在其他实施例中，修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含:A2R、A4W、A72Q、1841?、1^98：、6102八、12081^、丁279八^3025、丁3615』3916、04026、八4166、¥4381?、以及丁441〇。仍在其他实施例中，修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含:A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。仍在其他实施例中，修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、或SEQIDNO:6中列出的植物EPSPS多肽。[0017]可以通过CRISPRCas指导RNA介导的系统、锌指核酸酶介导的系统、大范围核酸酶介导的系统、或寡核碱基介导的系统修饰内源植物EPSPS基因。[0018]本文提供了在植物细胞中提供指导RNA的多核苷酸构建体，其中该指导RNA靶向植物细胞的内源EPSPS基因，并且该多核苷酸构建体进一步包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：（aA2R、（bA4W、（cH54M、（dA72Q、（eK84R、（fL98C、（gK173R、⑹I208L、（iK243E、（jT279A、⑹E302S、（IT361S、（mE391P、nE391G、⑹D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:I中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDNO:2具有至少90%同一性的序列。在一些实施例中，该多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个、至少三个、或至少四个氨基酸突变，该组由以下组成：（aA2R、（bA4W、（cH54M、⑹A72Q、（eK84R、（fL98C、（gK173R、⑹I208L、（iK243E、（jT279A、（kE302S、（IT361S、（mE391P、（nE391G、（oD402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和（tF442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQIDNO:1中列出的氨基酸突变位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDNO:2具有至少90%同一性的序列。[0019]在其他实施例中，该多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含:A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。仍在其他实施例中，该多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含:A2R、A4W、A72Q、K84R、1^98：、6102厶、12081^、了279厶^3025、了3615^3916、04026、厶4166、¥4381?、以及了441〇。仍在其他实施例中，该多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含:A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。仍在其他实施例中，该多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、或SEQIDNO:6中列出的氨基酸序列。[0020]本文提供了用于产生草甘膦耐受性植物的方法，其中将指导RNA、一种或多种多核苷酸修饰模板、和一种或多种Cas内切核酸酶提供至植物细胞。这一种或多种内切核酸酶在植物细胞中的内源EPSPS基因处引入双链断裂，并且这一种或多种多核苷酸修饰模板被用于产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的EPSPS基因，该EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成:aA2R、⑹A4W、（cH54M、（dA72Q、（eK84R、（fL98C、gK173R、（hI208L、（iK243E、（jT279A、（kE302S、⑴T361S、（mE391P、（nE391G、（oD402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:1中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDN0:2具有至少90%同一性的序列。从植物细胞获得植物，并且产生了没有指导RNA和Cas内切核酸酶的草甘膦耐受性子代植物。在一些实施例中，该一种或多种多核苷酸修饰模板被用来产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个、至少三个、或至少四个氨基酸突变，该组由以下组成：（aA2R、（bA4W、（cH54M、（dA72Q、（eK84R、（fL98C、（gK173R、（hI208L、⑴K243E、（jT279A、（kE302S、（IT361S、（mE391P、（nE391G、（οD402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQIDN0:l中列出的氨基酸突变位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDN0:2具有至少90%同一1性的序列。[0021]在其他实施例中，该一种或多种多核苷酸修饰模板被用来产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含:A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。仍在其他实施例中，该一种或多种多核苷酸修饰模板被用来产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含:A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、丁3613^3916、04026^4166、¥4381?、以及了441〇。仍在其他实施例中，该一种或多种多核苷酸修饰模板被用来产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含:A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。仍在其他实施例中，该一种或多种多核苷酸修饰模被用于产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、或SEQIDNO:6中列出的氨基酸序列。[0022]本文还提供了表达内源EPSPS多肽的草甘膦耐受性玉米植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成:aA2R、⑹A4W、（cH54M、（dA72Q、（eK84R、（fL98C、（gK173R、⑹I208L、（iK243E、（jT279A、⑹E302S、（IT361S、mE391P、（nE391G、⑹D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和（tF442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQIDN0:1中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDN0:2具有至少90%同一性的序列。草甘膦耐受性玉米植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、或SEQIDNO:6中列出的序列。[0023]本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性向日葵植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成:aA2R、⑹A4W、（cH54M、（dA72Q、（eK84R、（fL98C、（gK173R、⑹I208L、（iK243E、（jT279A、⑹E302S、（IT361S、mE391P、（nE391G、⑹D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和（tF442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQIDNO:I中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDN0:9具有至少90%同一性的序列。草甘膦耐受性向日葵植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQIDNO:10中列出的序列。[0024]本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性稻植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成:aA2R、（bA4W、（cH54M、（dA72Q、（eK84R、（fL98C、（gK173R、⑹I208L、（iK243E、（jT279A、⑹E302S、（IT361S、（mE391P、nE391G、⑹D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQIDNO:I中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDN0:7具有至少90%同一性的序列。草甘膦耐受性稻植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQIDNO:11中列出的序列。[0025]本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性高粱植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成:aA2R、⑹A4W、（cH54M、（dA72Q、eK84R、（fL98C、（gK173R、（hI208L、⑴K243E、（jT279A、（kE302S、（IT361S、（mE391P、（nE391G、⑹D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQIDNO:I中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDN0:8具有至少90%同一性的序列。草甘膦耐受性高粱植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQIDNO:12中列出的序列。[0026]本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性大豆植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成:aA2R、⑹A4W、（cH54M、（dA72Q、eK84R、（fL98C、（gK173R、（hI208L、⑴K243E、（jT279A、（kE302S、（IT361S、（mE391P、（nE391G、⑹D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQIDNO:I中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDNO:13具有至少90%同一性的序列。草甘膦耐受性大豆植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQIDNO:18中列出的序列。[0027]本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性小麦植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成:aA2R、⑹A4W、（cH54M、（dA72Q、eK84R、（fL98C、（gK173R、（hI208L、⑴K243E、（jT279A、（kE302S、（IT361S、（mE391P、（nE391G、⑹D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQIDNO:I中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDNO:14具有至少90%同一性的序列。草甘膦耐受性小麦植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQIDNO:19中列出的序列。[0028]本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性芜菁植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成:aA2R、⑹A4W、（cH54M、（dA72Q、eK84R、（fL98C、（gK173R、（hI208L、⑴K243E、（jT279A、（kE302S、（IT361S、（mE391P、（nE391G、⑹D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQIDNO:I中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDNO:15具有至少90%同一性的序列。草甘膦耐受性芜菁植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQIDN0:20中列出的序列。[0029]本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性番茄植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成:aA2R、⑹A4W、（cH54M、（dA72Q、eK84R、（fL98C、（gK173R、（hI208L、⑴K243E、（jT279A、（kE302S、（IT361S、（mE391P、（nE391G、⑹D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQIDNO:I中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDNO:17具有至少90%同一性的序列。草甘膦耐受性番茄植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQIDNO:21中列出的序列。[0030]本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性马铃薯植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成:aA2R、⑹A4W、（cH54M、（dA72Q、（eK84R、（fL98C、（gK173R、⑹I208L、（iK243E、（jT279A、⑹E302S、（IT361S、mE391P、（nE391G、⑹D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和（tF442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQIDNO:I中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDN0:18具有至少90%同一性的序列。草甘膦耐受性马铃薯植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQIDN0:22中列出的序列。[0031]还提供了杂草控制的方法，其中将有效量的草甘膦施用在本文提供的草甘膦耐受性植物群体上。这些植物可以是玉米、向日葵、稻、小麦、番前、马铃薯、油菜、高粱、或大豆。施用的有效量的草甘膦可以是约50克酸当量英亩至约2000克酸当量英亩。[0032]还提供了包含部分EPSP合酶EPSPS序列的多核苷酸修饰模板，其中多核苷酸修饰模板包含对应于G102A的和对应于选自下组的至少一个或多个氨基酸突变的一个或多个核苷酸突变，该组由以下组成:aA2R、bA4W、cH54M、dA72Q、eK84R、fL98C、gKl73R、hI208L、iK243E、jT279A、kE302S、lT361S、mE391P、nE391G、oD402G、pA416G、qV438R、rS440R、sT441Q、和tF442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDN0:l中列出的氨基酸位置。还提供了包含本文呈现的多核苷酸修饰模板、指导RNA、和CRISPRCas9内切核酸酶的植物细胞，其中所述组合靶向编码EPSPS多肽的内源玉米EPSPS序列，该EPSPS多肽与SEQIDNO:2具有至少90%的同一性。[0033]还提供的是在抑制剂存在下，快速测定多种酶变体的催化效率的方法。该方法包括：（a提供多种酶变体；⑹提供抑制剂；（c提供底物；⑹在不多于两个不同抑制剂浓度下，进行反应，该反应涉及多种酶变体和底物；（e在不多于两个不同抑制剂浓度下，测量反应速率；以及f计算多种酶变体的kcatKM*KI。在一些实施例中，抑制剂浓度之一是零。在其他实施例中，底物是处于与酶变体的亲本酶的米氏常数KM基本上相似的浓度。仍在其他实施例中，酶是处于在该两种不同抑制剂浓度下，足以导致基本上线性反应速率的浓度。仍在其他实施例中，抑制剂浓度之一足以导致至少约50%抑制。仍在其他实施例中，在高通量系统中进行测定。仍在其他实施例中，通过获得kcatKM*ΚΙ的数值估算在抑制剂存在下的催化能力，其中kcat是最大酶转换率，KM是米氏常数，并且KI是抑制剂解离常数。在一些实施例中，底物是PEP;抑制剂是草甘膦;并且多种酶变体是EPSPS酶变体。在一些实施例中，在两个抑制剂浓度下，酶浓度和底物浓度是相同的。附图说明[0034]图1显示玉米野生型EPSPS氨基酸序列（SEQIDNO:1和EPSPS序列的突变的H6版本（SEQIDNO:5的比对。[0035]图2显示大豆野生型EPSPS氨基酸序列（SEQIDNO:13和EPSPS序列的突变的H6版本SEQIDNO:18的比对。[0036]图3显示向日葵野生型EPSPS氨基酸序列（SEQIDNO:9和EPSPS序列的突变的H6版本SEQIDNO:10的比对。[0037]图4显示稻野生型EPSPS氨基酸序列（SEQIDN0:7和EPSPS序列的突变的H6版本SEQIDNO:11的比对。[0038]图5显示高粱野生型EPSPS氨基酸序列（SEQIDNO:8和EPSPS序列的突变的H6版本SEQIDNO:12的比对。[0039]图6示小麦野生型EPSPS氨基酸序列（SEQIDNO:14和EPSPS序列的突变的H6版本SEQIDNO:19的比对。[0040]图7显示芜菁野生型EPSPS氨基酸序列（SEQIDNO:15和EPSPS序列的突变的H6版本（SEQIDNO:20的比对。[0041]图8显示高粱野生型EPSPS氨基酸序列（SEQIDNO:8和EPSPS序列的突变的Cl版本（SEQIDNO:23的比对。[0042]图9显示毛状根从用天然玉米EPSPS或改组的变体之一转化的大豆子叶的生长。[0043]图10显示与底物饱和分析相比，通过快速方法确定的（kcatKM術的值。将来自表15的数据绘制为线性回归。用于快速方法的值是在调节的条件下获得的那些。[0044]序列表简述[0045]这些序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.8211.825所列出的管理专利申请中核苷酸和氨基酸序列公开内容的规定。如遵循描述于以下文献中的IUPACIUBMB标准所定义的，序列表包含核苷酸序列字符的单字母代码和氨基酸的三字母代码：NucleicAcidsRes.[核酸研究]13:302130301985和BiochemicalJ.[生物化学杂志]2192:3453731984，以上文献通过引用并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822中列出的规定。[0046]SEQIDNO:1是通过将合成EPSP合酶其中修饰编码SEQIDNO:2的基因的核苷酸序列，用来添加N末端蛋氨酸至SEQIDN0:2,并且用来优化密码子使用，以便其在大肠杆菌中表达克隆进表达载体获得的表达的蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:1在本文中要被用作参照EPSPS序列。[0047]SEQIDNO:2是呈现为GenBank条目CAA44974.1NCBIGI编号1524383的玉米EPSPS的氨基酸序列。[0048]SEQIDNO:3是N末端延伸的氨基酸序列。[0049]SEQIDNO:4是由克隆771-C2中存在的核苷酸序列编码的玉米EPSPS的氨基酸序列。[0050]SEQIDNO:5是由克隆868-H6中存在的核苷酸序列编码的玉米EPSPS的氨基酸序列。[0051]SEQIDN0:6是由克隆123-C1中存在的核苷酸序列编码的玉米EPSPS的氨基酸序列。[0052]SEQIDNO:7是来自稻Oryzasativa的天然EPSPS的氨基酸序列，其包含叶绿体转运肽序列。[0053]SEQIDN0:8是来自高粱（石茅（Sorghumhalepense的天然EPSPS的氨基酸序列，其包含叶绿体转运肽序列。[0054]SEQIDNO:9是来自向日葵Helianthusannus的天然EPSPS的氨基酸序列，其包含叶绿体转运肽序列。[0055]SEQIDNO:10是来自向日葵的EPSPS序列（SEQIDN0:9的突变版本，其包含868-H6突变。[0056]SEQIDN0:11是来自稻的EPSPS序列（SEQIDN0:7的突变版本，其包含868-H6突变。[0057]SEQIDN0:12是来自高粱的EPSPS序列（SEQIDN0:8的突变版本，其包含868-H6突变。[0058]SEQIDNO:13是来自大豆Glycinemax的天然EPSPS的氨基酸序列，其包含叶绿体转运肽序列。[0059]SEQIDNO:14是来自小麦（Triticumaestivum的天然EPSPS的氨基酸序列，其包含叶绿体转运肽序列。[0060]SEQIDNO:15是来自芜菁的天然EPSPS的氨基酸序列，其包含叶绿体转运肽序列。[0061]SEQIDNO:16是来自番前（SolanumIycopersicum的天然EPSPS的氨基酸序列，其包含叶绿体转运肽序列。[0062]SEQIDNO:17是来自马铃薯Solanumtuberosum的天然EPSPS的氨基酸序列其包含叶绿体转运肽序列。[0063]SEQIDNO:18是来自大豆的EPSPS序列（SEQIDNO:13的突变版本，其包含868-H6突变。[0064]SEQIDNO:19是来自小麦的EPSPS序列（SEQIDNO:14的突变版本，其包含868-H6突变。[0065]SEQIDN0:20是来自芜菁的EPSPS序列（SEQIDNO:15的突变版本，其包含868-H6突变。[0066]SEQIDNO:21是来自番茄的EPSPS序列（SEQIDNO:16的突变版本，其包含868-H6突变。[0067]SEQIDNO:22是来自马铃薯的EPSPS序列（SEQIDNO:17的突变版本，其包含868-H6突变。[0068]SEQIDN0:23是来自高粱的EPSPS序列（SEQIDN0:8的突变版本，其包含123-C1突变。[0069]SEQIDNO:24是编码天然玉米EPSPS和C末端血球凝集素亲和标签但不是叶绿体转运肽）的DNA序列。[0070]SEQIDNO:25是编码玉米EPSPS变体868-H6和C末端血球凝集素亲和标签但不是叶绿体转运肽）的DNA序列。[0071]SEQIDN0:26是编码来自拟南芥EPSPS的叶绿体靶向肽的DNA序列。[0072]SEQIDNO:27是编码称作6H1的人工CTP的核苷酸序列（美国专利号7,345,143。[0073]SEQIDN0:28是天然拟南芥EPSPS启动子的核苷酸序列AT1G48860;NCBIGI编号CP002684·1，拟南芥染色体1，碱基对18071332至18072324。[0074]SEQIDN0:29是拟南芥泛素-3启动子的核苷酸序列（NCBIGI编号GenBankL05363.1〇[0075]SEQIDN0:30是拟南芥泛素-10UBQ10启动子的启动子的核苷酸序列。[0076]SEQIDNO:31是编码血球凝集素亲和标签的多核苷酸的序列。[0077]SEQIDNO:32是菜豆球蛋白终止子的核苷酸序列。[0078]SEQIDNO:33是编码玉米EPSPS变体Cl和C末端血球凝集素亲和标签但不是叶绿体转运肽）的DNA序列。[0079]SEQIDNO:34是编码玉米EPSPS变体C2和C末端血球凝集素亲和标签但不是叶绿体转运肽）的DNA序列。[0080]发明详述[0081]I.组合物[0082]A.EPSP合酶多核苷酸和多肽[0083]提供了采用具有EPSP合酶EPSPS活性的多核苷酸和多肽的不同方法和组合物。此类EPSPS多肽包括编码植物EPSPS多肽的那些，这些植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个或多个氨基酸突变，该组由以下组成：（aA2R、（bA4W、（cH54M、（dA72Q、（eK84R、（fL98C、（gK173R、⑹I208L、（iK243E、（jT279A、⑹E302S、⑴T361S、（mE391P、nE391G、⑹D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQIDNO:I中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS多肽包含与SEQIDNO:2具有至少90%同一性的序列。[0084]在一些实施例中，这些多核苷酸编码植物EPSPS多肽，这些植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个氨基酸突变，该组由以下组成：（aA2R、（bA4W、（cH54M、（dA72Q、（eK84R、tfL98C、（gK173R、（hI208L、iK243E、（jT279A、（kE302S、⑴T361S、（mE391P、（nE391G、（〇D402G、（pA416G、（qV438R、（rS440R、（sT441Q、和⑴F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDN0:l中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS多肽包含与SEQIDN0:2具有至少90%同一性的序列。[0085]在其他实施例中，该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含:A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V这些突变存在于克隆771-C2中）。仍在其他实施例中，该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q这些突变存在于克隆868-H6中）。仍在其他实施例中，该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含:A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G这些突变存在于克隆123-C1中）。仍在其他实施例中，该多核苷酸编码SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、或SEQIDN0:6中列出的植物EPSPS多肽，SEQIDN0:4、SEQIDN0:5和SEQIDN0:6代表由分别存在于771-C2、868-H6、和123-C1中的核苷酸序列编码的玉米EPSPS多肽的氨基酸序列。[0086]当与先前鉴定的EPSPS多肽比较时，在草甘膦存在下，本文公开的EPSPS多肽及其活性变体和片段会具有改进的催化能力。最好地表明体内此性状的适应度的参数是kMt1¾*¾。当与先前已知的EPSPS酶比较时，本文公开的EPSPS多肽会具有增加的kc^Ki^K〗。“增加”意在是当与适当的对照比较时，任何统计显著的增加。在一些实施例中，适当的对照是先前已知的EPSPS序列，例如SEQIDN0:2玉米）、SEQIDN0:7稻）、SEQIDN0:8高粱）、SEQIDN0:9向日葵）、SEQIDN0:13大豆）、SEQIDN0:14小麦）、SEQIDN0:15芜菁）、SEQIDNO:16潘茄）、或SEQIDNO:17马铃薯）中列出的那些。在一些实施例中，当与SEQID勵：2、7、89、13、14、15、16、或17比较时，1^^1«*11的增加可以包括约150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800倍或更大倍数的增加。仍在另外的实施例中，kcatKM*Ki可以包括例如大于约2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、或更大的kcatKM*Ki。野生型玉米EPSPS的kcatKM*Ki是11·8，而包含1031、107S、和445G的EPSPS酶的kcatKM*Ki是2254。[0087]如本文所使用的，“分离的”或“纯化的”多核苷酸或多肽或其生物活性部分是基本上或本质上不含与如在其天然存在的环境中发现的多核苷酸或多肽正常相伴或相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或多肽当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。最佳地，“分离的”多核苷酸不含在从其衍生出该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然地在该多核苷酸侧翼的序列（即，位于该多核苷酸的5和3末端的序列）（最佳地是蛋白质编码序列）。出于本公开的目的，“分离的”或“重组的”当用于指核酸分子时不包括分离的未改性的染色体。例如，在不同实施例中，该分离的多核苷酸可以包含小于约51^3、41UbiQ3天然的）。与未喷雾的对照相比，用含有UbiQlO启动子和H6变体的构建体转化的植物不具有可见的损伤或生长抑制。尽管天然EPSPS用更强的其松子赋予了一些耐受性，但是在每一条件下，H6变体的改进的适合性（[kcatKm]*Ki清楚地可见。[0371]实例6[0372]用于在转化的大豆中，赋予草甘膦耐受性的改组的植物EPSPS的功效[0373]构建转化载体，由编码天然玉米EPSPS、玉米EPSPS变体H6、玉米EPSPS变体CU抑或玉米EPSPS变体C2的核苷酸序列组成核苷酸序列分别被提供为SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDN0:33、或SEQIDN0:34。各自前面是编码称作6H1的人工CTP的核苷酸序列（美国专利号7,345，143;SEQIDN0:27。所得CTP酶组合前面是天然拟南芥EPSPS启动子AT1G48860;SEQIDN0:28、泛素-3启动子（SEQIDN0:29、抑或泛素-10启动子Norris等人1993.同上；SEQIDN0:30。将编码血球凝集素亲和标签的多核苷酸（核苷酸序列是SEQIDN0:31融合至每个EPSPS编码区的C-末端，随后是菜豆球蛋白终止子SEQIDNO:32〇[0374]使用标准分子生物学技术构建用于农杆菌介导的转化的二元载体。使用从Cho等人Cho等人2000.Planta[植物]210:195-204的方法略微修改的方法，进行大豆93Y21毛状根转化，其中用发根土壤杆菌菌株K599用表13中所述的二元载体转化的悬浮液感染受伤的子叶外植体。[0375]表13.用于拟南芥转化的二元载体的描述[0377]在共培养后，将外植体置于含有卡那霉素的生长培养基上，用于转化转殖项的选择，具有或不具有25uM草甘膦。在缺乏草甘膦的培养基上，未转化的子叶形成根的密集生长，但是在含有25uM草甘膦的相同培养基上没有生长未显示）。在缺乏草甘膦的培养基上，用所有构建体转化的子叶形成密集的根生长，与用未转化的子叶所见的现象不可区别（图9。未从用构建体其中编码EPSPS的基因是由更弱的启动子UBQ3和天然的）驱动的）转化的子叶形成毛状根。然而，在25uM草甘膦的存在下，用含有UBQlO启动子和H6、C1以及C2变体的构建体转化的子叶产生毛状，而天然EPSPS不支持根生长。[0378]实例7[0379]EPSPS基因座的内源基因组编辑[0380]针对其在EPSPS基因组靶序列处引入一个或多个双链断裂的能力，开发并且评估玉米优化Cas9内切核酸酶。通过将信号添加至moCas9编码序列的5末端，玉米优化Cas9内切核酸酶moCas9通常补充有核定位信号（例如SV40。随后，通过将内含子插入moCas9编码序列，修饰植物m〇Cas9表达盒，以增强其在玉米细胞中的表达，并且以消除其在大肠杆菌和农杆菌中的表达。玉米泛素启动子和马铃薯蛋白酶抑制剂II基因终止子序列补足了moCas9内切核酸酶基因设计。然而，可以使用任何其他启动子和或终止子。[0381]单指导RNASgRNA表达盒包括例如U6聚合酶III玉米启动子及其同源U6聚合酶终止序列。指导RNA包括核苷酸可变靶向结构域，随后是能够与双链断裂诱导内切核酸酶相互作用的RNA序列。[0382]在EPSPS密码子序列内的玉米优化Cas9内切核酸酶靶序列m〇Cas9靶序列）与指导sgRNA的核苷酸可变序列（该序列确定EPSPS编码序列内的Cas9内切核酸酶切割的位点）互补。基于要被靶向至EPSPS基因座内的突变的性质和数目，此靶向区域可以变化。[0383]合成m〇CAS9靶序列并且将其克隆进设计用于通过农杆菌介导的转化，将指导RNA-Cas9系统的组分递送进玉米细胞的指导RNA-Cas9表达载体。如果需要的话，农杆菌T-DNA还递送酵母FLP位点特异性重组酶和WDV小麦矮缩病毒复制相关蛋白復制酶）。如果m〇Cas9靶序列侧翼是FLP重组靶FRT，则可以用形成游离基因的（染色体样结构）的玉米细胞中的FLP将它们切下。通过允许其在大肠杆菌细胞中回收的WDV复制酶复制此类环状DNA片段将复制起点嵌入到WDV启动子中）。如果玉米优化Cas9内切核酸酶在m〇Cas9靶序列处造成双链断裂，则其修复可能产生突变。在以下文献中详细描述了该程序=Lyznik，L.A.，Djukanovic，V.，Yang，M.和Jones，S.2012Double-strandbreak-inducedtargetedmutagenesisinplants.[植物中的双链断裂诱导的革巴向诱变]在以下中：Transgenicplants:MethodsandProtocols[转基因植物：方法和方案]Dunwell，J.M.和Wetten，A.C.编辑）.纽约，海德堡，多德雷赫特，伦敦:施普林格出版公司（Springer，第399-416页。本文所述的玉米优化Cas9内切核酸酶在玉米细胞中是功能的，并且在m〇Cas9靶序列处有效产生双链断裂。[0384]为了实现玉米染色体EPSPS基因的靶向基因组编辑，可以产生用于编辑EPSPS编码序列的多核苷酸修饰模板，并且将其与指导RNACas9系统一起共递送。可以存在同时地或顺序地递送的多于一个的修饰模板。[0385]当与要编辑的天然EPSPS基因组序列相比时，多核苷酸修饰模板包括一个或多个核苷酸修饰例如，对应于本文公开的一个或多个氨基酸改变的核苷酸改变）。这些核苷酸修饰通常是取代突变。EPSPS模板序列可以编码功能EPSPS蛋白或可以是并不编码全长功能多肽的部分片段。[0386]使用粒子轰击，EPSPS多核苷酸修饰模板可以与指导sgRNA表达盒和玉米优化Cas9内切核酸酶表达载体一起共递送，该玉米优化Cas9内切核酸酶表达载体含有玉米优化Cas9内切核酸酶表达盒和选择性标记基因。在轰击之前，将十至十一天龄的未成熟胚按胚轴向下置于含N6培养基上，并且在28°C孵育4-6小时。在PDS-IOOO装置中，将这些板置于从底数的第三层搁板上，并且按200psi进行轰击。轰击后，将胚在28°C，在黑暗中孵育过夜，转移至含有N6-2培养基的板上，并且然后在28°C储存6-8天。然后将胚转移至含有N6-3培养基的板上，持续三周。然后将响应的愈伤组织转移至含有N6-4培养基的板上，持续另外三周的选择。在28°C总计六周的选择后，将少量的选择的组织转移至MS再生培养基上，并且在28°C，在黑暗中，孵育三周。[0387]针对靶向点突变的存在，筛选含有针对选择性标记的适当底物例如针对moPAT选择性标记基因的bialophos的培养基上的选择的多个愈伤组织事件。进行EPSPS基因座的进一步测序，以确认突变。按照标准程序，从愈伤组织事件产生小植株。[0388]实例8[0389]在抑制剂存在下，针对多种酶变体的快速高通量酶测定[0390]定向进化的商业应用之一是使酶脱敏，以便例如被除草剂抑制。Kcat、lKM和心是三个维度，当相乘时是针对在抑制剂存在时的催化，酶的内在能力的量度。当尝试通过定向进化优化那些值时，fcatKM*K:可以是用于评估变体文库的信息性参数。然而，通过底物饱和分析评估数百个变体的kratKM*Κ:，可以不提供足够的通量。使得能够分离在等式的一例的（kratKM*Κι的米氏方程的操作，是用来加快测定的通量的一种方法。如果底物浓度和酶浓度是相同的，但是在两个不同抑制剂浓度其中一个可以是〇测量速度，则此实例证明数据足以仅用两次速率测量，计算kc^tKM*K:。通过关联用快速方法获得的值与通过底物饱和动力学获得的那些值，验证该程序。[0391]定向进化是在由商业或学术目的定义的特性方面，用于改进酶的适应度的过程，由体外产生的变体的适应度的经验观察所定向。在其中目标是使酶对抑制剂例如除草剂或反馈抑制代谢物脱敏的情况下，将通过提高KI酶抑制剂复合物的解离常数的值，进行改进，如方案1所示。[0393]很少会这样，造成KI的增加而不影响其他参数，所以捕获所有三个参数的一些测量是优选要使用的。参数kc^tKM*心组合了催化效率的表示kc^tKM与和底物相比，对抑制剂的亲和力的表示KIKM。用增加的kMt、增加的Km、增加的心或任何组合获得改进的kcatKn*Κι〇增加kcat比减小Km更有效：[0395]增加心是有效的，直至其达到大约抑制剂浓度，此后进一步增加将成比例地增加kcatKn*Κι，但是仅会导致Vi的另外2倍的增加。[0396]如果已知的话，则通过在底物和抑制剂浓度、pH和离子强度的条件下，测量反应速度，进行变体的文库的直接评估。用等式1描述获得的速率。如果在酶改进项目开始时，速度设置在作为改进的唯一标准的应用条件下，则技术人员冒着变得受困于导致与远远更高的潜在最大值分开的峰值的序列上下文的风险。技术人员可以通过具有替代性适应度参数其捕获在单个参数中的一个或两个中改进的变体），避免一直下降至底部。监测WKMhK1具有以下益处:揭示给定单个参数的值的更有利分布，是否可以获得更多优化。例如，在与当前最适变体处于同等水平的应用条件下具有V1的变体可以具有:足够高的K1，这样使得倍或更多倍大于其他候选者。在米氏方程中，可以用一些取样计算见到这样一种变体的值。如果1^是5000碰并且KMlOOuM，并且如果I和S的浓度分别是IOOOuM和20uM，则在速率方程中的分母是140。然而，如果通进一步诱变，ΚΘΡΚμ分别成比例地减小（例如5倍）至1000和20uM，则分母将是60，并且Vi将增加2.33倍（14060。因此，WKm^Ki可以是有用的代数余子式，用来在用于指导定向进化的应用条件下，测量V1，该定向进化针对:对抑制剂的不敏感性。[0397]通常，通过在抑制剂不存在和存在下，进行底物饱和分析，获得kc^tKM。然而，分析持续更长时间。因此，使得能够仅用两次速率测量准确估算kratKM*K:的用于竞争性抑制的米氏方程的新颖处理显著增加通量并且加快了用于评估数百和数千个变体的筛选过程。为了验证该方法，针对玉米5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS及其竞争性抑制剂草甘膦，使用两种方法-传统的饱和和即刻的方法快速），量化kcWKw*ΚΙ3[0398]在用于具有竞争性抑制的稳态反应速度的米氏方程中，由于分母中的Km和[S]项，不能分离项kc^tKw+K1。然而，如果在不同抑制剂浓度下进行两次速率测量，则可以通过减法和分离的kcatKM*KI，消除那些项，如下：[0402]其中VjPv2是在相同底物（[S]和酶（[E]浓度下，但是在两个抑制剂浓度[I]1和[1]2下的初速度。此外，当[1]2=〇时，等式2可以被简化为：[0404]其中νθΡνι是具有和不具有抑制剂的情况下，但是在相同底物和酶浓度下的初速度。尽管等式2和3是同样有效的，但是为了产生表1中的数据，使用等式3,在具有和不具有抑制剂的情况下，进行速率测量。[0405]试剂、酶和变体的来源[0406]从克雷白氏肺炎杆菌aroA-ATCC25597的培养物制备莽草酸-3-磷酸S3P。将来自在2xYT中生长的500ml培养物的细胞用于接种增加有55uM酪氨酸、60uM苯丙氨酸、25uM色氨酸、0.IuM4-氨基苯甲酸盐和0.IuM4-羟基苯甲酸盐的6L的基本培养基Weiss等人，1953.JAmerChemSoc[美国化学学会学报]75:5572-5576。挺阴离子交换HPLC监测S3P的累积。在37°C摇动4天后，浓度达到约ImM。用高达0.7M的梯度洗脱，在pH7.3，用碳酸氢铵中的阴离子交换色谱法从培养上清液纯化S3PA3P干净地与被洗脱更早的磷酸盐分开。2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核糖核苷MESG来自SetarehBiotech公司，尤金，俄勒闪州。所有其他试剂来自西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich。[0407]从GenBank条目CAA44974·lSEQIDN0:2获得成熟玉蜀黍EPSPS的氨基酸序列。产生核苷酸序列以便添加N末端蛋氨酸并且用来优化密码子使用，用于在大肠杆菌中表达。将合成的基因克隆进表达载体，该表达载体提供驱动蛋白和l〇xN末端组氨酸标签的表达的T7启动子。选择用于此研究的变体包括天然玉米EPSPS和通过本文所述的基因改组级联产生的变体。在大肠杆菌BL21DE3中表达蛋白并且通过Ni-NTA树脂凯杰公司（Qiagen进行纯化。使用0.6760DmgmL的消光系数，通过在280nm处的吸光度，确定蛋白浓度。将蛋白归一化至〇.5mgmL用于测定。[0408]酶测定程序和数据分析[0409]EPSPS催化以下反应:磷酸烯醇丙酮酸PEP+3-磷酸莽草酸S3P=磷酸盐Pi+5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸EPSP通过将反应产生的磷酸盐量化，确定EPSPS活性。使用标准方法，由嘌呤-核苷磷酸化酶催化，将磷酸盐的释放偶联至与MESG的反应。使用Spectramax酶标仪分子仪器公司MolecularDevices，在360nm处监测到发生的吸光度改变，其中消光度是11，200M-lcm-l。为了以常规方式确定动力学参数，按七个浓度第八个是空白，不含底物）（范围从15uM至800uM存在PEP，并且不变的底物S3P按200uM的饱和浓度存在。5微升的PEP的60倍浓储备溶液置于96孔测定板的孔中，并且通过添加含有25mMHepes，pH7，100mMKCl，5%vv乙二醇，0.2mMMESG，1单位ml嘌呤-核苷磷酸化酶西格玛公司（SigmaN8264，200uMS3P和EPSPS的混合物开始反应。调节酶浓度，以产生足够的信号，而不超过线性初始反应速率的极限。用草甘膦的两个或三个浓度重复相同程序，并且用具有图板棱柱®raphPadPrismgraphpad.com的非线性回归分析加工数据，并且全局拟合至针对竞争性抑制的米氏方程。[0410]对于该新颖的方法，使用相同的测定条件。PEP浓度设置在30uM，其接近野生型EPSPS的KM，同时S3P按200uM存在。将EPSPS的浓度固定在0.07uM。用或不用ImM草甘膦作为抑制剂，一式三份进行反应。将VQ和Vi的值代入等式3，产生WKm術。[0411]为了验证快速方法产生的准确估算，将结果与通过全底物饱和分析获得的那些进行比较。针对玉米5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸EPSP合酶的天然的和该组的变体，获得数据。为了建立实际的和替代的WKm^Ki之间的关联，选择显示大范围的已知单个参数的一组变体，用于通过快速方法的分析。天然玉米EPSPS和另一EPSPS形成该范围的下端和高端。由Zm-H6EPSPS及其单突变供应在中间的值。通过天然玉米EPSPS的基因该组产生Zm-H6EPSPS，并且相对于天然酶，具有16个突变，如本文所述。变体的动力学参数跨越以下范围：对于kcat，39倍，对于KM，37倍，对于KI，10000倍，并且对于kcatKM*Κι，9000倍。通过全部两种方法获得的所有参数显示在表15中。通过底物饱和分析和快速方法确定的WKm術的值的线性回归，显示贯穿值的范围的优异关联图10。[0412]用两个简单反应，产生集总参数UKMhK1，捕获了在抑制剂存在下，催化必需的动力学特性。给定适当的测定，可以用自动液体处理进行这两个反应，使得能够评估数百个变体。这些测量将伴随在使用相同自动测定的应用的条件下的速率测量。[0413]当涉及抑制时，（UKm乘以K1另外捕获抑制剂解离常数的幅度。第一步将是在应用条件下的速率测量，和用于通过快速方法确定kratKM*K:的两个测量。接下来，将完整批次的kcatKM的值与如通过在应用条件下的速率标准确定的最佳变体的那些值进行比较。如果kcatKM秘:的值明显超过了在应用条件下的最佳变体所拥有的那些值，则指明例外的单个参数存在于群体内并且进一步优化是可能的。在突出的单个参数和特异性突变之间的任何关联可以表明多个策略，通过这些策略，可以在一种酶中捕获最佳单个参数。因此，当依赖于作为唯一筛选标准的应用条件下的速率时，会有助于在稍后轮的改组中的改进的性能的有益突变会丢失。通过表14中提供的假设数据说明了这一点。[0414]表14:针对酶变体的假设动力学数据[0416]应用条件：[S]，20uM;[I]，IOOOuM;[E]，IuM[0417]在应用条件下的催化性能V1方面，相比变体B，变体A是更好的变体，即使变体B具有远远更大的（kcatKM*KI，仅仅由于其17.5倍更高的KI。如以上解释的，高于[I]的KI的值具有对vi的减少的影响，最高达到2倍。然而，在稍后轮的该组中，这一特性可以潜在交换为更低的KM变体C或更高的kcat变体D，以便最后获得具有与其亲本中的任一者相比，在应用条件下的更佳性能的变体。[0418]存在若干实际考虑，用于使用快速方法准确估算〇^ΚΜ*ΚΙ31必须发现在具有和不具有抑制剂的两种情况下，产生线性初始反应速率的酶浓度。2必须调节抑制剂浓度，以获得在等式3的项，最小地放大误差的抑制程度。如果抑制太小，则vo-^将很小，并且乘数^XVQVo-V1中的误差将很大。将50%抑制设置为目标。3底物浓度应设置在一个或多个亲本变体的大约Km，符合测定的敏感性。高底物浓度掩盖了对抑制剂的敏感性，并且减小了严格性，用于捕获Km中的改进。取决于速度的必要性，存在定制酶的和抑制剂的浓度的机会。表15显示选择的条件，对于准确分析变体中的一些，0.07uM酶和ImM草甘膦是不适当的。重复快速方法用于那些数据和获得的数据，这些数据更好地符合用底物饱和分析获得的数据。然而，出于筛选目的，相关步骤不是必需的。可以设置条件，这样使得准确量化具有预定最小适应度水平的变体。[0419]在表15中，在标准条件下，获得高于快速方法的粗线的参数。对于显示低于粗线的变体，用根据需要调节的酶浓度或草甘膦浓度，重复快速分析，以产生线性初始速率的极限内的足够的信号。[0420]因此，总之，此实例证明，可以仅用两次速率测量确定kcatKM+K1，以便评估多种酶变体。因为它量化了在抑制剂存在下，催化的内在能力，（kratKM捕获了具有突变的多个变体，这些变体特性可以并入随后轮的优化中。由于其含有作为经历改进的参数的KM，该方法还适合体内应用，其中不存在对底物浓度的控制。

权利要求：1.一种多核苷酸，其编码植物EPSP合酶EPSPS多肽，其中该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个或多个氨基酸突变，该组由以下组成：aA2R，bA4ff,cH54M，dA72Q，eK84R，fL98C,gK173R，hI208L，iK243E,jT279A,kE302S，lT361S,mE391P，nE391G，oD402G,pA416G,qV438R，rS440R,sT441Q，以及tF442V,其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:I中列出的氨基酸位置，并且其中该植物EPSPS多肽包含与SEQIDNO:2具有至少90%同一性的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个或更多个氨基酸突变，该组由以下组成：（a-t。3.如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。4.如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q。5.如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、WD402G。6.如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸编码SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、或SEQIDNO:6中列出的植物EPSPS多肽。7.—种重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含如权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸。8.—种植物细胞，该植物细胞包含如权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸或如权利要求7所述的重组DNA构建体。9.如权利要求8所述的植物细胞，其中所述植物细胞是玉米细胞。10.—种植物，在其基因组中包含如权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸或如权利要求7所述的重组DNA构建体。11.如权利要求10所述的植物，其中所述植物是玉米。12.—种产生草甘膦耐受性植物的方法，该方法包括：a在可再生植物细胞中表达包含可操作地连接到至少一种调节序列的多核苷酸的重组DNA构建体，其中该多核苷酸编码植物EPSP合酶EPSPS多肽，该EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：i.A2R，ii.A4ff,iii.H54M，iv.A72Q,V.K84R，vi.L98C,vii.K173R,viii.I208L，ix.K243E,X.T279A，xi.E302S，xii.T361S，xiii.E391P，xiv.E391G,xv.D402G,xvi·A416G，xvii.V438R,xviii.S440R,xix.T441Q，以及xx.F442V;其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:I中列出的氨基酸位置，并且其中该植物EPSPS多肽包含与SEQIDNO:2具有至少90%同一性的序列；以及b产生该草甘膦耐受性植物，其中该草甘膦耐受性植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体。13.如权利要求12所述的方法，其中所述方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个氨基酸突变，该组由以下组成：（a-t。14.如权利要求12所述的方法，其中所述方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含:A4W、H54ML98C、G102A、K173RI208L、K243EE302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。15.如权利要求12所述的方法，其中所述方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含:A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、T441Q。16.如权利要求12所述的方法，其中所述方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含:A2R、A4W、K84R、L98C、K208L、K243E、E391P、#D402G。17.如权利要求12所述的方法，其中所述方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、或SEQIDNO:6中列出的氨基酸序列。18.—种产生草甘膦耐受性植物的方法，所述方法包括：a.修饰植物细胞中的内源植物EPSP合酶EPSPS基因以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：i.A2R，ii.A4ff,iii.H54M，iv.A72Q,V.K84R，vi.L98C,vii.K173R,viii.I208L，ix.K243E,X.T279A，xi.E302S，xii.T361S，xiii.E391P，xiv.E391G,xv.D402G,xvi·A416G，xvii.V438R,xviii.S440R,xix.T441Q，以及xx.F442V,其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:I中列出的氨基酸位置，并且其中该内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDN0:2具有至少90%同一性的序列；以及b.从所述植物细胞生长植物，其中所述植物是对草甘膦耐受的。19.如权利要求18所述的方法，其中所述修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白具有选自下组的氨基酸突变中的至少两个，该组由以下组成：（ai-aXX。20.如权利要求18所述的方法，其中所述修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含:A4W、H54ML98C、G102A、K173RI208L、K243EE302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、#F442V。21.如权利要求18所述的方法，其中所述修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含:A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、WT441Q。22.如权利要求18所述的方法，其中所述修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含:A2R、A4W、K84R、L98C、K208L、K243E、E391P、及D402G〇23.如权利要求18所述的方法，其中所述修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白具有SEQIDN0:4、SEQIDNO:5、或SEQIDNO:6中列出的氨基酸序列。24.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中该内源植物EPSPS基因已经通过CRISPRCas指导RNA介导的系统进行修饰。25.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中该内源植物EPSPS基因已经通过锌指核酸酶介导的系统进行修饰。26.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中该内源植物EPSPS基因已经通过大范围核酸酶介导的系统进行修饰。27.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中该内源植物EPSPS基因已经通过寡核碱基介导的系统进行修饰。28.—种多核苷酸构建体，该多核苷酸构建体在植物细胞中提供指导RNA，其中该指导RNA靶向植物细胞的内源EPSP合酶EPSPS基因，并且所述多核苷酸构建体进一步包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：aA2R，bA4ff,cH54M，dA72Q，eK84R，fL98C,gK173R，hI208L，iK243E,jT279A,kE302S，lT361S,mE391P，nE391G，oD402G,pA416G,qV438R，rS440R,sT441Q，以及tF442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:I中列出的氨基酸位置，并且其中该内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDNO:2具有至少90%同一性的序列。29.如权利要求28所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽具有选自下组的氨基酸突变中的至少两个，该组由以下组成:a-t。30.如权利要求28所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含:A4W、H54ML98C、G102A、K173RI208L、K243EE302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。31.如权利要求28所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含:A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、#T441Q〇32.如权利要求28所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含:A2R、A4W、K84R、L98C、K208L、K243E、E391P、以及D402G。33.如权利要求28所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、或SEQIDNO:6中列出的氨基酸序列。34.—种用于生产草甘膦耐受性植物的方法，该方法包括：a提供指导RNA、至少一种多核苷酸修饰模板、以及至少一种Cas内切核酸酶至植物细胞，其中该至少一种Cas内切核酸酶在该植物细胞中的内源EPSP合酶EPSPS基因处引入双链断裂，并且其中所述多核苷酸修饰模板用于产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：i.A2R，ii.A4ff,iii.H54M，iv.A72Q,V.K84R，vi.L98C,vii.K173R,viii.I208L，ix.K243E,X.T279A，xi.E302S，xii.T361S，xiii.E391P，xiv.E391G，xv.D402G，xvi.A416G，xvii.V438R，xviii.S440R?xix.T441Q，以及XX.F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:I中列出的氨基酸位置，并且其中该内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDNO:2具有至少90%同一性的序列；b从a的植物细胞获得植物；以及d从⑹的植物产生没有所述指导RNA和Cas内切核酸酶的草甘膦耐受性子代植物。35.如权利要求34所述的方法，其中该至少一种多核苷酸修饰模板产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽具有选自下组的氨基酸突变中的至少两个，该组由以下组成:a-t。36.如权利要求34所述的方法，其中该至少一种多核苷酸修饰模板产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含：A4W、H54ML98C、G102A、K173RI208L、K243EE302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、#F442V。37.如权利要求34所述的方法，其中该至少一种多核苷酸修饰模板产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含:A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、#T441Q。38.如权利要求34所述的方法，其中该至少一种多核苷酸修饰模板产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含:A2R、A4W、K84R、L98C、K208L、K243E、E391P、以及D402G。39.如权利要求34所述的方法，其中该至少一种多核苷酸修饰模板产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽具有SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、或SEQIDNO:6中列出的氨基酸序列。40.—种草甘膦耐受性玉米植物，其表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：aA2R，bA4ff,cH54M，dA72Q，eK84R，fL98C,gK173R，hI208L，iK243E,jT279A,kE302S，lT361S,mE391P，nE391G，oD402G,pA416G,qV438R，rS440R,sT441Q，以及tF442V,其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:I中列出的氨基酸位置，并且其中该植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDN0:2具有至少90%同一性的序列。41.一种草甘膦耐受性向日葵植物，其表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含与G102A类似的氨基酸突变和与选自下组的氨基酸突变类似的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：aA2R，bA4ff,cH54M，dA72Q，eK84R，fL98C,gK173R，hI208L，iK243E,jT279A,kE302S，lT361S,mE391P，nE391G，oD402G,pA416G,qV438R，rS440R,sT441Q，以及tF442V,其中每个氨基酸位置对应于SEQIDNO:I中列出的类似氨基酸突变位置，并且其中该植物EPSPS多肽包含与SEQIDNO:9具有至少90%同一性的序列。42.—种草甘膦耐受性稻植物，其表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含与G102A类似的氨基酸突变和与选自下组的氨基酸突变类似的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：aA2R，bA4ff,cH54M，dA72Q，eK84R，fL98C,gK173R，hI208L，iK243E,jT279A,kE302S，lT361S,mE391P，nE391G，oD402G,pA416G,qV438R，rS440R,sT441Q，以及tF442V,其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:I中列出的类似氨基酸位置，并且其中该植物EPSPS多肽包含与SEQIDNO:7具有至少90%同一性的序列。43.—种草甘膦耐受性高粱植物，其表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含与G102A类似的氨基酸突变和与选自下组的氨基酸突变类似的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：aA2R，bA4ff,cH54M，dA72Q，eK84R，fL98C,gK173R，hI208L，iK243E,jT279A,kE302S，lT361S,mE391P，nE391G，oD402G,pA416G,qV438R，rS440R,sT441Q，以及tF442V,其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:I中列出的类似氨基酸位置，并且其中该植物EPSPS多肽包含与SEQIDNO:8具有至少90%同一性的序列。44.一种草甘膦耐受性大豆植物，其表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含与G102A类似的氨基酸突变和与选自下组的氨基酸突变类似的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：aA2R，bA4ff,cH54M，dA72Q，eK84R，fL98C,gK173R，hI208L，iK243E,jT279A,kE302S，lT361S,mE391P，nE391G，oD402G,pA416G,qV438R，rS440R,sT441Q，以及tF442V,其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:I中列出的类似氨基酸位置，并且其中该植物EPSPS多肽包含与SEQIDNO:13具有至少90%同一性的序列。45.—种草甘膦耐受性小麦植物，其表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含与G102A类似的氨基酸突变和与选自下组的氨基酸突变类似的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：aA2R，bA4ff,cH54M，dA72Q，eK84R，fL98C,gK173R，hI208L，iK243E,jT279A,kE302S，lT361S,mE391P，nE391G，oD402G,pA416G,qV438R，rS440R,sT441Q，以及tF442V,其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:I中列出的类似氨基酸位置，并且其中该植物EPSPS多肽包含与SEQIDNO:19具有至少90%同一性的序列。46.—种草甘膦耐受性芜菁植物，其表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含与G102A类似的氨基酸突变和与选自下组的氨基酸突变类似的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：aA2R，bA4ff,cH54M，dA72Q，eK84R，fL98C,gK173R，hI208L，iK243E,jT279A,kE302S，lT361S,mE391P，nE391G，0D402G,ρA416G,qV438R，rS440R,sT441Q，以及tF442V,其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:1中列出的类似氨基酸位置，并且其中该植物EPSPS多肽包含与SEQIDNO:20具有至少90%同一性的序列。47.—种草甘膦耐受性番茄植物，其表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含与G102A类似的氨基酸突变和与选自下组的氨基酸突变类似的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：aA2R，bA4ff,cH54M，dA72Q，eK84R，fL98C,gK173R，hI208L，1K243E,jT279A,kE302S，lT361S,mE391P，nE391G，oD402G,pA416G,qV438R，rS440R,sT441Q，以及tF442V,其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:I中列出的类似氨基酸位置，并且其中该植物EPSPS多肽包含与SEQIDNO:21具有至少90%同一性的序列。48.—种草甘膦耐受性马铃薯植物，其表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含与G102A类似的氨基酸突变和与选自下组的氨基酸突变类似的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：aA2R，bA4ff,cH54M，dA72Q，eK84R，fL98C,gK173R，hI208L，iK243E,jT279A,kE302S，lT361S,mE391P，nE391G，oD402G,pA416G,qV438R，rS440R,sT441Q，以及tF442V,其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:I中列出的类似氨基酸位置，并且其中该植物EPSPS多肽包含与SEQIDNO:22具有至少90%同一性的序列。49.一种杂草控制的方法，该方法包括将有效量的草甘膦施用在草甘膦耐受性植物群体上，其中所述草甘膦耐受性植物包含如权利要求1所述的多核苷酸。50.如权利要求49所述的方法，其中所述草甘膦耐受性植物是玉米植物。51.如权利要求49所述的方法，其中所述草甘膦耐受性植物是如权利要求40-48所述的草甘膦耐受性植物中的任一者。52.如权利要求49所述的方法，其中施加的有效量的草甘膦是约50克酸当量英亩至约2000克酸当量英亩。53.—种多核苷酸修饰模板，其包含部分EPSP合酶EPSPS序列，其中该多核苷酸修饰模板包含对应于G102A的和对应于选自下组的至少一个或多个氨基酸突变的一个或多个核苷酸突变，该组由以下组成：cA2R，dA4ff,eH54M，fA72Q，gK84R，hL98C，iK173R，jI208L，kK243E,lT279A,mE302S，nT361S,oE391P，pE391G，qD402G，rA416G,sV438R,tS440R，uT441Q，以及vF442V,其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO:I中列出的氨基酸位置。54.—种植物细胞，其包含如权利要求53所述的多核苷酸修饰模板、指导RNA、和CRISPRCas9内切核酸酶，其中组合的该多核苷酸修饰模板、指导RNA、和CRISPRCas9靶向编码EPSPS多肽的内源玉米EPSPS序列，该EPSPS多肽与SEQIDNO:2具有至少90%的同一性。55.—种在抑制剂存在下快速测定多种酶变体对底物的催化效率的方法，该方法包括：a提供该多种酶变体；⑹提供该抑制剂；c提供该底物；d在两种不同抑制剂浓度下，进行反应，该反应涉及该多种酶变体和该底物；e在这两种不同抑制剂浓度下，测量反应速率；以及⑴计算该多种酶变体的WKm*KI356.如权利要求55所述的方法，其中所述抑制剂浓度之一是零。57.如权利要求55所述的方法，其中该底物处于与酶变体的亲本酶的米氏常数Km基本上相似的浓度。58.如权利要求55所述的方法，其中该酶处于在这两种不同抑制剂浓度下，足以导致基本上线性反应速率的浓度。59.如权利要求55所述的方法，其中所述抑制剂浓度之一足以导致至少约50%抑制。60.如权利要求55所述的方法，其中该方法在高通量系统中进行。61.如权利要求55所述的方法，其中通过获得ΙμΚμ的数值来估算在抑制剂存在下的催化能力，其中krat是最大酶转换率，Km是米氏常数，并且K1是抑制剂解离常数。62.如权利要求55所述的方法，其中该底物是PEP，该抑制剂是草甘膦，并且该多种酶变体是EPSPS。63.如权利要求55所述的方法，其中在步骤d中，使用不多于两种不同浓度的抑制剂。64.如权利要求55所述的方法，其中在这两种抑制剂浓度下，该酶浓度和底物浓度是相同的。

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