申请/专利权人：中南林业科技大学

申请日：2019-03-27

公开（公告）日：2022-11-29

公开（公告）号：CN110079544B

主分类号：C12N15/80

分类号：C12N15/80;C12N15/90;C12N15/53;C12P17/18;C12R1/645

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.11.29#授权;2019.08.27#实质审查的生效;2019.08.02#公开

摘要：一种提高发酵液中红曲色素色价的方法，是通过红曲霉菌自带的同源重组系统，利用根癌农杆菌介导（ATMT）转化T‑DNA技术完成红曲霉菌中编码C‑2428甾醇还原酶的ERG4基因敲除，得到红曲色素高产菌株。本发明能够显著性提高发酵液中红曲色素的生产水平，液态发酵（10d）结果显示，出发菌株胞外色价和总色价分别为14.57UmL、106.54UmL，本发明构建的重组菌株胞外色价和总色价分别为21.55UmL、112.78UmL，胞外色价和总色价分别提高了47.90%、5.86%。

主权项：1.一种提高发酵液中红曲色素色价的方法，其特征在于：利用基因敲除技术使红曲霉菌中编码C-2428-甾醇还原酶的ERG4基因缺失，得到重组菌株，利用所述重组菌株发酵产红曲色素；所述红曲霉菌为紫色红曲霉菌M.purpureus；所述编码C-2428-甾醇还原酶的ERG4基因为monascus_08018，其核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。

全文数据：一种提高发酵液中红曲色素色价的方法技术领域本发明涉及一种提高发酵液中红曲色素色价的方法，具体地说，是涉及一种通过基因工程技术提高发酵液中红曲色素色价的方法。背景技术红曲色素作为一种天然食用色素在我国及东南亚等国家已有上千年的应用历史，在化学合成色素被证实具有不同程度的毒副作用后，红曲色素以其“天然、营养、多功能”的优点，在食品工业中具有很大的潜力。同时，由于红曲色素还具有调节血脂、降血压、防血管硬化、抗防过氧化等广泛的生物活性，因此，它在保健产品开发和医疗领域的应用也逐渐受到重视。红曲色素的生产方法主要有固态发酵和液态发酵两种。虽然固态发酵过程简单、投资小，但是固态发酵存在生产周期长、工艺条件难以精确控制、劳动密度大等缺点。因此，液态发酵法成为生产红曲色素工业化的主流，其中提高发酵产量，也就是提高色素色价成为当前的主要任务。液态发酵生产的红曲色素具有杂质少、周期短、产品质量稳定等优点，但此方法产生的色价不高，而产品售价较高，制约了其应用范围。目前，提高发酵液中红曲色素色价的方法目前主要从菌种筛选、菌种诱变、培养条件优化等方面进行。CN109234318A公开了一种提高红曲胞外色素的方法，该方法是将红曲霉菌中编码麦角甾醇合成途径上甾醇还原酶的ERG4ERG24家族的基因敲除。其记载的液态发酵结果显示，亲本菌株胞外红曲色素为4.92UmL，通过该方法构建的重组菌株胞外红曲色素达6.52UmL，胞外色素生产量提高32.52％，该方法能够提高红曲胞外色素的产量，但其红曲色素的色价仍然无法满足行业需求。CN109337932A公开了一种提高红曲色素产量的方法，该方法是从植物双元质粒pCambia0380载体出发，改造并构建了一种适合丝状真菌基因敲除的双元质粒载体pHph0380。在此基础上，从红色红曲霉CICC41233中克隆得到糖转运蛋白gltp1基因上下游同源臂片段，与质粒载体pHph0380连接后，通过根癌农杆菌EHA105介导将其转化至亲本红色红曲霉中，构建得到了重组菌株。该重组菌株发酵36h，红色红曲霉GLTP24醇溶色价为0.29U，相比亲本红色红曲霉CICC41233，醇溶色价为0.09U，提高了2倍。该重组菌株发酵144h，醇溶色价为49.46U。相比亲本红色红曲霉CICC41233，醇溶色价为28.42U，提高了74％，但其红曲色素的色价仍欠理想。以上所述现有技术受限于红曲霉菌自身的代谢特性，红曲色素累积很难再进一步提高，色价不高，无法满足行业需求。发明内容本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种工艺较简单，能够有效促进红曲色素产量满足行业需求的提高发酵液中红曲色素色价的方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种提高发酵液中红曲色素色价的方法，利用基因敲除技术使红曲霉菌中编码C-2428-甾醇还原酶的ERG4基因缺失，得到重组菌株，利用所述重组菌株发酵产红曲霉素。进一步，所述红曲霉菌为紫色红曲霉菌M.purpureus；所述编码甾醇还原酶的ERG4基因为monascus_08018，其核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。进一步，所述基因敲除技术是利用同源重组技术，通过根癌农杆菌EHA105（湖南大学生物学院于峰教授课题组赠送，属于常规商品化的生物材料）介导转化T-DNA技术使得紫色红曲霉菌中编码甾醇还原酶的ERG4基因monascus_08018缺失，具体包括以下步骤：（1）利用软件分析编码甾醇还原酶的ERG4基因monascus_08018的核苷酸序列；（2）以紫色红曲霉菌M.purpureusLQ-6的cDNA为模板，以8018-up-osc-F和8018-up-osc-R为第一对引物，以8018-dn-osc-F和8018-dn-osc-R为第二对引物，将两对引物分别进行PCR扩增得到monascus_08018基因的5＇端和3＇端同源臂片段；所述8018-up-osc-F的序列为SEQIDNo:2；所述8018-up-osc-R的序列为SEQIDNo:3；所述8018-dn-osc-F的序列为SEQIDNo:4；所述8018-dn-osc-R的序列为SEQIDNo:5；（3）以质粒pXS为模板，以G418-F和G418-R为一对引物进行PCR扩增得到G418基因片段；所述G418-F的序列为SEQIDNo:6；所述G418-R的序列为SEQIDNo:7；（4）采用OverlapPCR技术，以monascus_08018基因的5＇端和3＇端同源臂片段以及G418基因片段为模板，以8018-up-osc-F和8018-dn-osc-R为一对引物进行PCR扩增得到△8018目的片段；（5）用EcoRI和SalI双酶切双元表达载体pCAMBIA1300，胶回收线性化载体，利用一步克隆技术连接线性化双元载体pCAMBIA1300与△8018目的片段，即得到基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018；所述质粒pCAMBIA1300-△8018序列为SEQIDNo:12；（6）根癌农杆菌EHA105介导基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018，转化至紫色红曲霉菌中，筛选阳性克隆，即得到所述的液态发酵中红曲色素高产菌株。进一步，步骤（2）中所述紫色红曲霉M.purpureusLQ-6于2018年09月07日在中国典型保藏中心保藏，保藏编号是CCTCCM2018600。进一步，步骤（6）中所述根癌农杆菌EHA105介导基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018是通过液氮冻融法将所述基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018导入根癌农杆菌EHA105，具体步骤如下：取2μg所述基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018加入到200μL的根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，混匀后冰浴30min；液氮中速冻1min，后用37℃金属浴保温3min；加入800μL的YEB液体培养基，28℃培养3h；室温下以5000rpm的转速离心5min，浓缩菌体；取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50mgL利福平、50mgL卡那霉素的YEB选择性培养基平板上，28℃倒置培养48h；挑选转化子于YEB液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105。进一步，步骤（6）中所述含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105转化至紫色红曲霉菌中的步骤如下：将红曲菌接种到PDA斜培养基，30℃培养7d，用无菌水从斜面上洗下红曲菌孢子，通过两层无菌擦镜纸过滤，调节孢子浓度；取含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含50μgmL利福平，50μgmL卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，220rpm培养12～24h，取250μL的菌液于50mLMM培养基中，在相同条件下培养2d，测培养基中农杆菌的值，并用IM培养基稀释菌液至OD600值为0.15；再在相同条件下培养6h得农杆菌液备用；将所得的紫色红曲霉孢子液和含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于铺有玻璃纸的含200μmolL乙酰丁香酮的Co-IM诱导培养基平板上，25℃共培养。进一步，步骤（6）中所述筛选阳性克隆的具体步骤如下：将共培养4d后将玻璃纸揭起放入空的无菌培养皿中，然后倒入约含有50μgmLG418和500μgmL头孢霉素的PDA培养基，25℃培养，从第2天开始观察，将长出的菌落挑至含50μgmLG418的PDA培养基上，30℃培养7d；如果在培养基上仍然能生长，即推定为转化子，并将之接种到PDB液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，以提取基因组为模板，用两对引物8018-T-F和8018-T-R、G418-T-F和8018-half-R进行PCR验证，选取阳性菌株；所述8018-T-F的序列为SEQIDNo:8；所述8018-T-R的序列为SEQIDNo:9；所述G418-T-F的序列为SEQIDNo:10；所述8018-half-R的序列为SEQIDNo:11。进一步，所述根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备方法如下：将根癌农杆菌EHA105接种于5～10mL含有50mgL利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200rpm的条件培养约24～48h至对数生长期；取500μL活化的菌液接种于20mL含有50mgL利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200rpm的条件培养至菌液OD600=0.5；将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，收集菌体；用50mmolLCaCl2洗涤菌体两次，再重悬于2mL50mmolLCaCl2中，得到根癌农杆菌EHA105感受态细胞。在以上技术方案中，所述植物双元质粒pCAMBIA1300、根癌农杆菌EHA105，均属于常规商品化生物材料，可自市面购得，紫色红曲霉M.purpureusLQ-6于2018年09月07日在中国典型保藏中心（地址：武汉；简称“CCTCC”）保藏，保藏编号是CCTCCM2018600。在以上技术方案中，所述YEB培养基的配方如下：5gL牛肉膏，5gL蛋白胨，5gL蔗糖，4gL七水硫酸镁，1gL酵母粉，pH7.4；若为固体培养基则另加2%的琼脂粉。所述PDA培养基的配方如下：马铃薯去皮200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，pH自然。所述MM培养基的配方如下：2gL葡萄糖，2.05gLK2HPO4，1.45gLKH2PO4，0.5gLNH42SO4，0.01gLCaCl2，pH7.0，使用前每毫升培养基加入0.1%FeSO41μL，50mgmL卡那霉素1μL。所述IM培养基的配方如下：2gL葡萄糖，1.84gLK2HPO4，1.45gLKH2PO4，0.5gLNH42SO4，0.01gLCaCl2，5gL甘油，pH4.9，使用前每毫升培养基加入0.2mmolLAS1μL，100gLMES10μL，0.1%FeSO41μL。所述Co-IM培养基的配方如下：1gL葡萄糖，1.84gLK2HPO4，1.45gLKH2PO4，0.5gLNH42SO4，0.01gLCaCl2，5gL甘油，pH4.9，使用前每毫升培养基加入0.2mmolLAS1μL，100gLMES10μL，0.1%FeSO41μL。本发明之提高发酵液中红曲色素色价的方法中所构建得到的红曲霉素高产菌株也在本发明的保护范围之内。本发明是从基因工程技术领域提供了一种提高发酵液中红曲色素色价的方法，将红曲霉菌中编码C-2428-甾醇还原酶的ERG4还原酶基因敲除，有利于提高红曲霉菌胞膜的通透性，利用植物双元质粒pCAMBIA1300作为载体，通过根癌农杆菌EHA105介导T-DNA转化技术，敲除靶标的命中率和稳定性较好，将基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018转化至红曲霉菌中，转化效率较高，所构建得到了液态发酵中红曲色素高产菌株具有良好的传代稳定性。本发明有益效果：提供了一种简单、高效的提高发酵液中红曲色素色价的方法，在最佳发酵条件下（30℃，150rpm培养至色素生产稳定期即第10天），出发菌株M.purpureusLQ-6的胞外色素色价、总色素色价分别为14.57UmL、106.54UmL。本发明构建重组菌株红曲胞外色素色价、总色素色价分别为21.55UmL、112.78UmL，胞外色价和总色价分别提高了47.90%、5.86%，说明通过本发明的方法能够显著性提高发酵液中红曲色素的生产水平。生物材料保藏情况说明紫色红曲霉LQ-6，拉丁学名为Monascus.purpureusLQ-6，于2018年09月07日在中国典型保藏中心（地址：武汉；简称“CCTCC”）保藏，保藏编号是CCTCCM2018600。附图说明图1为本发明所涉及的重组质粒pCAMBIA1300-△8018的质粒图谱；图2为转化子PCR电泳图（泳道1：10000bpmarker；泳道2：2000bpmarker；泳道3：阴性对照；泳道4：亲本菌株；泳道6-8和12：基因8018完全敲除；泳道10、11：假阳性克隆；泳道5和9：基因8018不完全敲除；泳道13：亲本菌株；泳道14：-21：转化子）；图3为出发菌株和重组菌株液态发酵总红曲色素发酵动力学图；图4为出发菌株和重组菌株红曲胞外色素发酵动力学图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。本发明实施例所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。实施例1本实施例是利用基因敲除技术使紫色红曲霉菌M.purpureus中编码麦角甾醇合成途径上C-2428-甾醇还原酶的ERG4还原酶基因monascus_08018缺失，得到重组菌株，利用所述重组菌株发酵产红曲霉素；ERG4基因monascus_08018的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。本实施例基因敲除技术是利用同源重组技术，通过根癌农杆菌EHA105介导转化T-DNA技术使得紫色红曲霉菌中编码C-2428甾醇还原酶的ERG4基因monascus_08018缺失，包括以下步骤：1.紫色红曲霉菌Monascus_08018基因缺失突变株的基因敲除载体构建：（1）利用软件分析SEQIDNo:1所示的序列；（2）以紫色红曲霉菌的cDNA为模板，以8018-up-osc-F（序列为SEQIDNo:2）、8018-up-osc-R（序列为SEQIDNo:3）为一对引物和8018-dn-osc-F（序列为SEQIDNo:4）、8018-dn-osc-R（序列为SEQIDNo:5）为一对引物分别进行PCR扩增得到monascus_08018基因的5’和3’同源臂片段；（3）以质粒pXS为模板，以G418-F（序列为SEQIDNo:6）、G418-R（序列为SEQIDNo:7）为一对引物进行PCR扩增得到G418基因片段；（4）采用OverlapPCR技术，以monascus_08018基因的5’、3’同源臂片段以及G418基因片段为模板，以8018-up-osc-F和8018-dn-osc-R为一对引物进行PCR扩增得到△8018目的片段并测序，将测序正确的目的片段胶回收纯化；（5）用EcoRI和SalI双酶切双元表达载体pCAMBIA1300并回收，利用一步克隆连接酶将其与△8018目的片段连接，即得到基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018，其质粒图谱详见图1；2.将构建成功的载体pCAMBIA1300-△8018，转化亲本紫色红曲霉M.purpureusLQ-6，获得基因工程菌株紫色红曲霉△8018。2.1根癌农杆菌感受态细胞制备①将根癌农杆菌EHA105接种于5～10mL含有50mgL利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200rpm的条件培养约24～48h至对数生长期；②取500μL活化的菌液接种于20mL含有50mgL利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200rpm的条件培养至菌液OD600=0.5；③将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，收集菌体；④用预冷的50mmolLCaCl2洗涤菌体两次，再重悬于预冷的2mL50mmolLCaCl2中；⑤按每管200μL分装，液氮速冻1min；⑥此时的菌悬液可以直接转化，也可以储存于-80℃冰箱保存备用。上述YEB培养基：5gL牛肉膏，5gL蛋白胨，5gL蔗糖，4gL七水硫酸镁，1gL酵母粉，pH7.4；若为固体培养基则另加2%的琼脂粉。2.2液氮冻融法将双元质粒表达载体导入根癌农杆菌①取2μg所述基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018加入到200μL的根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，混匀后冰浴30min；②液氮中速冻1min，后用37℃金属浴保温3min；③加入800μL的YEB液体培养基，28℃培养3h；④室温下以5000rpm的转速离心5min，浓缩菌体；⑤取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50μgmL利福平、50μgmL卡那霉素的YEB选择性培养基平板上，28℃倒置培养48h；⑥挑选转化子于YEB液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105。2.3根癌农杆菌介导转化紫色红曲霉M.purpureusLQ-6（1）菌体准备紫色红曲霉M.purpureusLQ-6：将红曲菌接种到PDA斜培养基，30℃培养7d，用无菌水从斜面上洗下红曲菌孢子，通过两层无菌擦镜纸过滤，调节孢子浓度。根癌农杆菌：取含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含50μgmL利福平，50μgmL卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，220rpm12～24h，取250μL的菌液于50mLMM培养基中，在相同条件下培养2d，测培养基中农杆菌的值，并用IM培养基稀释菌液至OD600值为0.15。在相同条件下，培养6h得农杆菌液，备用。（2）农杆菌与紫色红曲霉M.purpureusLQ-6共培养将上述的紫色红曲霉孢子液和含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于铺有玻璃纸的含200μmolL乙酰丁香酮的Co-IM诱导培养基平板上，25℃共培养。（3）转化子筛选验证共培养4d后将玻璃纸揭起放入空的无菌培养皿中，然后倒入约含有50μgmLG418和500μgmL头孢霉素的PDA培养基，25℃培养，从第2天开始观察，将长出的菌落挑至含50μgmLG418的PDA培养基上，30℃培养7d。如果在培养基上仍然能生长，即推定为转化子，并将之接种到PDB液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，用两对引物8018-T-F（序列为SEQIDNo:8）和8018-T-R（SEQIDNo:9）、G418-T-F（SEQIDNo:10）和8018-half-R（SEQIDNo:11）进行PCR验证，选取阳性菌株，其电泳结果如图2所示，其中，泳道1：10000bpmarker；泳道2：2000bpmarker；泳道3：阴性对照；泳道4：亲本菌株；泳道6-8和12：基因8018完全敲除；泳道10、11：假阳性克隆；泳道5和9：基因8018不完全敲除；泳道13：亲本菌株；泳道13-21：重组菌株。经红曲色素初步发酵，确定一株菌株即△8018，为本发明的工程菌株紫色红曲霉（Monascuspurpureus）△8018。上述PDA培养基：马铃薯（去皮）200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，自然pH。3.新构建的重组菌株紫色红曲霉△8018与亲本株M.purpureusLQ-6发酵产胞外红曲色素以及总色素能力的对比。3.1采用PDA固体培养基培养将紫色红曲霉△8018与紫色红曲霉M.purpureusLQ-6，在PDA固体培养基培养7d后，用无菌水收集孢子悬液，并调至1×105个mL，接种量为10%。发酵条件为：30℃，150rpm发酵至第10天。发酵培养基：葡萄糖80gL，酵母粉2.5gL，麦芽浸膏2.5gL，蛋白胨2.5gL，KH2PO45gL，CaCl20.1gL，MgSO4·7H2O0.5gL，FeSO4·7H2O0.01gL，ZnSO4·7H2O0.01gLandMnSO4·7H2O0.03gL，pH=5。3.2红曲色素色价测定胞外红曲色素（水溶发酵液中）色价测定：将发酵液在离心管中定容至25mL，冷冻高速离心（10000rpm，10min），上清液即为胞外色素。取一定量的滤液用水稀释适当倍数，以水为参照，用紫外分光光度计测定稀释液的吸光度值（红色素吸收主峰在505nm，黄色素吸收主峰在420nm，桔色素吸收主峰在470nm），计算其总色价（红色素+黄色素+桔色素）。计算方法为：总色价=稀释倍数×吸光度。胞内红曲色素（醇溶）色价测定：发酵液离心后收集沉淀，用70%的乙醇在60℃下萃取2h，期间旋涡震荡数次。冷冻高速离心（10000rpm，20min），上清液即为胞内色素。取一定量的滤液用70%乙醇稀释适当倍数，以70%乙醇为参照，用紫外分光光度计测定稀释液的吸光度值（红色素吸收主峰在505nm，黄色素吸收主峰在420nm，桔色素吸收主峰在470nm），计算其总色价。计算方法同上。总色价为胞外红曲色素（水溶）色价与胞内红曲色素（醇溶）色价之和。紫色红曲霉△8018，在发酵第7天，胞外色价与总色价分别为14.57UmL、106.54UmL。相比亲本紫色红曲霉M.purpureusLQ-6，胞外色价与总色价分别为21.55UmL、112.78UmL，分别提高了47.90%和5.86%，结果如图3、图4所示。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表中南林业科技大学一种提高发酵液中红曲色素色价的方法2019-03-2712SIPOSequenceListing1.011902DNAmonascus_08018基因的核苷酸序列Monascuspurpureus1agctaaacaaagagtgtctcgtctaaatggaggcgttacactcttccaggatggctgcct60tatgtcattctcgttgacccatttctccttttatctctgcagtacgtcgtggactttctt120ccatttgtcacagtactcaattggtaggtcaattcctattaaggatcattatcatcgcac180tcgctaacaggcactgctattctatctagtattgtgtaatgatatggctgttcaaagttc240agcgaatgtggaagcccgtcaagggcatgccaatggcaccatcgggaaaatggacaagaa300agccaacagcactcccaaggactttgcgagggagcggtgccctgtaatggatcccagggt360tgactactccggccattttgagttcgggggctctctggggactttggctctcatgatcgg420cttcccccttctgatgtactacatgtggattggagccacctactacgatggcaaattacc480actaccaaaggatggccagttatggggagactttggcaggcatatggtgcaccttgtcta540ctcgggggcatttcctcatgctagggcgtggcgcatctactggacctactatatcttcga600ggctgcatgctacatctttctcccgggcttcacttcttatggcaagccattgcctcacct660gggtgggaaacaactcgtctaccactgctctgcctataccagcttctatgtcaccatctt720agtgatggcggttttgcatggcaccggactattccccatctacacctttctggatgaatt780cggtcccctcatgtcggtttcgatcatttccggcttcctggccagttactttgcctactt840ctctgcgtttgcccgcggtgcccaacacagaatcaccggctacccgatctacgatttctt900tatgggcgccgagctaaacccacgcctcttcggcatcctggatttcaagatgttccatga960agttcgcatcccatggtttatcctctttggtttaacctgcgccgccgccgctcgtcagta1020cgaaaactatggctatgtctcaggcgaggtcatgttcctcgtcatggccca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权利要求：1.一种提高发酵液中红曲色素色价的方法，其特征在于：利用基因敲除技术使红曲霉菌中编码C-2428-甾醇还原酶的ERG4基因缺失，得到重组菌株，利用所述重组菌株发酵产红曲霉素。2.根据权利要求1所述提高发酵液中红曲色素色价的方法，其特征在于：所述红曲霉菌为紫色红曲霉菌M.purpureus；所述编码C-2428-甾醇还原酶的ERG4基因为monascus_08018，其核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。3.根据权利要求1或2所述提高发酵液中红曲色素色价的方法，其特征在于：所述基因敲除技术是利用同源重组技术，通过根癌农杆菌EHA105介导转化T-DNA技术使得紫色红曲霉菌中编码甾醇还原酶的ERG4基因monascus_08018缺失，包括以下步骤：（1）利用软件分析编码甾醇还原酶的ERG4基因monascus_08018的核苷酸序列；（2）以紫色红曲霉菌M.purpureusLQ-6的cDNA为模板，以8018-up-osc-F和8018-up-osc-R为第一对引物，以8018-dn-osc-F和8018-dn-osc-R为第二对引物，将两对引物分别进行PCR扩增得到monascus_08018基因的5＇端和3＇端同源臂片段；所述8018-up-osc-F的序列为SEQIDNo:2；所述8018-up-osc-R的序列为SEQIDNo:3；所述8018-dn-osc-F的序列为SEQIDNo:4；所述8018-dn-osc-R的序列为SEQIDNo:5；（3）以质粒pXS为模板，以G418-F和G418-R为一对引物进行PCR扩增得到G418基因片段；所述G418-F的序列为SEQIDNo:6；所述G418-R的序列为SEQIDNo:7；（4）采用OverlapPCR技术，以monascus_08018基因的5＇端和3＇端同源臂片段以及G418基因片段为模板，以8018-up-osc-F和8018-dn-osc-R为一对引物进行PCR扩增得到△8018目的片段；（5）用EcoRI和SalI双酶切双元表达载体pCAMBIA1300，胶回收线性化载体，利用一步克隆技术连接线性化双元载体pCAMBIA1300与△8018目的片段，即得到基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018；所述质粒pCAMBIA1300-△8018序列为SEQIDNo:12；（6）根癌农杆菌EHA105介导基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018，转化至紫色红曲霉菌中，筛选阳性克隆，即得到所述的液态发酵中红曲色素高产菌株。4.根据权利要求3所述提高发酵液中红曲色素的方法，其特征在于：步骤（2）中所述紫色红曲霉M.purpureusLQ-6于2018年09月07日在中国典型保藏中心保藏，保藏编号是CCTCCM2018600。5.根据权利要求3或4所述提高发酵液中红曲色素色价的方法，其特征在于：步骤（6）中所述根癌农杆菌EHA105介导基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018是通过液氮冻融法将所述基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018导入根癌农杆菌EHA105，具体步骤如下：取2μg所述基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018加入到200μL的根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，混匀后冰浴30min；液氮中速冻1min，后用37℃金属浴保温3min；加入800μL的YEB液体培养基，28℃培养3h；室温下以5000rpm的转速离心5min，浓缩菌体；取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50mgL利福平、50mgL卡那霉素的YEB选择性培养基平板上，28℃倒置培养48h；挑选转化子于YEB液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105。6.根据权利要求3～5之一所述提高发酵液中红曲色素色价的方法，其特征在于，步骤（6）中所述含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105转化至紫色红曲霉菌中的步骤如下：将红曲菌接种到PDA斜培养基，30℃培养7d，用无菌水从斜面上洗下红曲菌孢子，通过两层无菌擦镜纸过滤，调节孢子浓度；取含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含50μgmL利福平，50μgmL卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，220rpm培养12～24h，取250μL的菌液于50mLMM培养基中，在相同条件下培养2d，测培养基中农杆菌的值，并用IM培养基稀释菌液至OD600值为0.15；再在相同条件下培养6h得农杆菌液备用；将所得的紫色红曲霉孢子液和含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于铺有玻璃纸的含200μmolL乙酰丁香酮的Co-IM诱导培养基平板上，25℃共培养。7.根据权利要求3～6之一所述的提高发酵液中红曲色素色价的方法，其特征在于，步骤（6）中所述筛选阳性克隆的具体步骤如下：将共培养4d后将玻璃纸揭起放入空的无菌培养皿中，然后倒入约含有50μgmLG418和500μgmL头孢霉素的PDA培养基，25℃培养，从第2天开始观察，将长出的菌落挑至含50μgmLG418的PDA培养基上，30℃培养7d；如果在培养基上仍然能生长，即推定为转化子，并将之接种到PDB液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，以提取基因组为模板，用两对引物8018-T-F和8018-T-R、G418-T-F和8018-half-R进行PCR验证，选取阳性菌株；所述8018-T-F的序列为SEQIDNo:8；所述8018-T-R的序列为SEQIDNo:9；所述G418-T-F的序列为SEQIDNo:10；所述8018-half-R的序列为SEQIDNo:11。8.根据权利要求3～7之一所述提高发酵液中红曲色素的方法，其特征在于：所述根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备方法如下：将根癌农杆菌EHA105接种于5～10mL含有50mgL利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200rpm的条件培养约24～48h至对数生长期；取500μL活化的菌液接种于20mL含有50mgL利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200rpm的条件培养至菌液OD600=0.5；将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，收集菌体；用50mmolLCaCl2洗涤菌体两次，再重悬于2mL50mmolLCaCl2中，得到根癌农杆菌EHA105感受态细胞。

百度查询： 中南林业科技大学 一种提高发酵液中红曲色素色价的方法

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