申请/专利权人：顾岩

申请日：2022-08-25

公开（公告）日：2022-12-30

公开（公告）号：CN115531409A

主分类号：A61K31/7105

分类号：A61K31/7105;A61K47/46;A61P35/00;A61P7/10

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.01.20#实质审查的生效;2022.12.30#公开

摘要：本发明公开了利用MSC‑miRNA‑198‑exo治疗NSCLC相关恶性胸腔积液的方法，包括以下步骤：步骤一，转染MSC；步骤二，提取MSC‑miRNA‑198‑exo；步骤三，构建裸鼠MPE模型；步骤四，干预恶性胸腔积液小鼠；步骤五，评估疗效；所述步骤二中，MSC‑miR‑198所用培养体系为无血清培基；所述步骤二中，电镜及粒径结果显示，获取的外泌体形态呈杯托样、大小约40‑160nm的双膜层囊泡状结构；所述步骤三中，注射剂量为每次250ug只；本发明以MSC‑exo为媒介，可保护miRNA免受RNA酶活性的影响，具有低免疫原性和低细胞毒性、且稳定性和生物相容性高等优点，经基因修饰后所构建出的MSC‑miRNA‑198‑exo能明显抑制胸腔内肿瘤的生长和恶性胸腔积液的形成，在肺癌相关恶性胸腔积液的无细胞治疗中具有广阔的应用前景。

主权项：1.利用MSC-miRNA-198-exo治疗NSCLC相关恶性胸腔积液的方法，包括以下步骤：步骤一，转染MSC；步骤二，提取MSC-miRNA-198-exo；步骤三，构建裸鼠MPE模型；步骤四，干预恶性胸腔积液小鼠；步骤五，评估疗效；其特征在于：其中在上述步骤一中，取1EP管加1200μlOPTI-MEM，加入9μgpCL-Ampho和15μgpMXS-hsa-miR-198-GFPuro#7质粒，再加入84μlLipofectamineTM2000转染试剂，混匀静置15min；200μl质粒-转染试剂混合物加至293T细胞的培养板中，温育2h；加4ml293T完全培养液，培养过夜；24h后更换为新鲜培养液；48h、72h、96h收集病毒上清，收集的病毒液在35℃，3000×g离心10min，再经0.45μm过滤器过滤；过滤的病毒液加入polybrene工作浓度为2.5ngμl，混匀；5ml病毒液加入接种MSC的6孔板中，构建过表达miR-198的MSC细胞；转然后荧光显微镜及qT-PCR验证转染效率；其中在上述步骤二中，对上述步骤一中所获取的MSC-miR-198细胞进行培养，在3代至10代的细胞培融合度达85％左右时，收集细胞培养上清，使用超速离心法提取外泌体；通过电子透射显微镜及粒径分析验证提取的外泌体，通过BCA蛋白浓度测定外泌体浓度；其中在上述步骤三中，取BALBc裸鼠，腹腔内注射麻醉，碘伏消毒心前区皮肤，剑突右侧上方约1cm处做一个长约0.5cm的纵行切口，找到肋骨及肋间隙，避开血管用1ml胰岛素注射器在肋间隙注入以100ulPBS重悬的6×106对数期的A549细胞，注射完毕后缝合伤口，对皮消毒，青霉素粉末涂抹伤口；裸鼠在A549细胞造模后的第14天及第28天进行PET-CT扫描；其中在上述步骤四中，在A549细胞造模后的第5天、7天、9天时胸腔内注射PBS重悬的MSC-miR-198-exo；其中在上述步骤五中，观察并检测上述步骤四中的实验小鼠，观察得出：给予MSC-miRNA-198-Exos的小鼠胸膜组织的血管数量减少，胸膜血管渗透性降低，小鼠胸腔内肿瘤的生长和恶性胸腔积液的形成受到明显抑制；ELISA检测结果为：MSC-miRNA-198-Exo治疗的小鼠肿瘤组织中血管内皮生长因子受体VEGF的表达显著降低；Westernblot检测结果为：MSC-miRNA-198-Exos治疗的恶性胸腔积液小鼠组织中c-MET和p-ERK活性均明显被抑制；分析得出：MSC-miRNA-198-Exo对NSCLC相关恶性胸腔积液具有良好的治疗效果。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 顾岩 利用MSC-miRNA-198-exo治疗NSCLC相关恶性胸腔积液的方法

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