申请/专利权人：天康生物股份有限公司

申请日：2018-09-19

公开（公告）日：2023-03-31

公开（公告）号：CN109136267B

主分类号：C12N15/866

分类号：C12N15/866;C07K14/18;C07K16/10;G01N33/577

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.03.31#授权;2019.01.29#实质审查的生效;2019.01.04#公开

摘要：本发明提供了一种BVDVErns蛋白和抗体及筛选BVDV感染的牛的方法，涉及生物技术领域，该BVDVErns蛋白使用昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达，其表达的蛋白和与该蛋白结合的单克隆抗体，以及包含该Erns蛋白和或单克隆抗体的试剂盒可以广泛的应用于BVDV的相关研究。当牛经BVDVE2亚单位疫苗免疫后，牛的血清中会存在结合BVDVE2蛋白的抗体而不存在能够与BVDVErns蛋白相结合的抗体。当牛被BVDV的全病毒感染、或者经全病毒的灭活疫苗免疫后，牛的血清中会存在可以与BVDVErns蛋白相结合的抗体。因此本发明利用这二者之间的差异，来判断经BVDVE2亚单位疫苗免疫后的牛是否被BVDV病毒感染，方便快捷。

主权项：1.一种BVDVErns蛋白在制备鉴定BVDVE2亚单位疫苗投予的牛是否BVDV感染的试剂盒的用途；编码BVDVErns蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

全文数据：BVDVErns蛋白和抗体及筛选BVDV感染的牛的方法技术领域本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种BVDVErns蛋白和抗体及筛选BVDV感染的牛的方法。背景技术牛病毒性腹泻病毒在纽约州首先发现，是一种以腹泻、咳嗽和发热为主的牛传染性疾病，称为牛病毒性腹泻BVD。后又发现一种发病率低而死亡率高，以胃肠道广泛溃疡为明显病变的牛的疾病，称为粘膜病Mucosaldisease，MD。1971年美国兽医协会将牛病毒性腹泻BVD和粘膜病MD统一命名为牛病毒性腹泻粘膜病，简称BVDMD。牛病毒性腹泻病毒Bovineviraldiarrheavirus，BVDV是黄病毒科Flaviviridae瘟病毒属Pestivirus的代表种，BVDV与属内的猪瘟病毒Classicalswinefevervirus，CSFV和绵羊的边界病毒Borderdiseasevirus，BDV存在抗原相关性，在血清学上存在着交叉反应，而且能够突破宿主特异性发生交叉感染，因此BVDV不仅是牛的重要病原之一，而且能够感染绵羊、山羊、猪、鹿和其它反刍动物。BVDV病毒粒子近球形，直径约为40-60nm，核衣壳直径为25-30nm，有囊膜。在CsCl中浮密度为1.14gcm3，沉降系数S20＝140。病毒对乙醚、氯仿以及pH3.0敏感。病毒不耐热，56℃可使其灭活，MgCl2对病毒不起保护作用。病毒在低温下稳定，真空冻干的病毒可在-60～-70℃下保存较长时间。BVDV基因组为单股正链RNA，基因组大小约为12.5kb，分为5’端非翻译区、开放阅读框架区和3’端非翻译区。其中E2蛋白是决定BVDV抗原性的主要部位，也是与抗BVDV抗体结合、介导免疫中和反应与宿主细胞识别、吸附的主要部位。编码E2蛋白的基因位于ORF的2077-3198位，由374个氨基酸残基组成。非糖基化蛋白分子量约为42kDa。BVDVE2亚单位疫苗即将上市，但用于鉴别免疫疫苗产生抗体还是感染野毒产生抗体的有效检测方法尚未建立。并且在目前的研究中BVDV相关的蛋白研究较少，缺少研究BVDV的相关蛋白和抗体，以至于缺乏建立鉴别免疫疫苗产生抗体还是感染野毒产生抗体的有效检测方法的技术基础。有鉴于此，特提出本发明。发明内容本发明的第一目的在于提供了一种表达BVDVErns蛋白的表达载体，缓解了现有技术中存在的缺乏一种能够表达BVDVErns蛋白的载体和系统的问题。本发明的第二目的在于提供了一种上述表达载体表达的BVDVErns蛋白，该蛋白可以广泛的应用于BVDV的相关研究，为BVDV相关的分子生物学实验奠定了物质基础。本发明的第三目的在于提供了一种与上述BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体，该单克隆抗体可以广泛的应用于BVDV的相关研究，为BVDV相关的分子生物学实验奠定了物质基础。本发明的第四目的在于提供了一种试剂盒，该试剂盒包含BVDVErns蛋白和或与BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体，可以应用于多种研究BVDV的分子生物学实验中。本发明的第五目的在于提供了一种上述BVDVErns蛋白、与上述BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体或试剂盒在检测BVDV中的用途，该用途广泛，适用于检测BVDV以及BVDV包含的蛋白或是抗BVDV的抗体。本发明的第六目的在于提供了一种筛选BVDV野生毒株感染的牛的方法，缓解了现有技术中存在的，缺乏一种从经BVDVE2亚单位疫苗免疫的牛中，筛选出感染了BVDV野生毒株的牛的方法的问题。为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：一种表达BVDVErns蛋白的表达载体，所述表达载体表达如SEQIDNO.1所示序列编码的Erns蛋白；所述表达载体为杆状病毒；进一步的，所述BVDVErns蛋白由昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达。本发明还提供了一种上述表达载体表达的BVDVErns蛋白；进一步的，所述BVDVErns蛋白经标记物标记；进一步的，所述标记包括荧光标记、酶标记或生物素标记。本发明还提供了一种与上述BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体；进一步的，所述单克隆抗体经标记物标记；进一步的，所述标记包括荧光标记、酶标记或生物素标记。本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含上述BVDVErns蛋白和或上述单克隆抗体。进一步的，所述试剂盒为ELISA试剂盒；所述ELISA试剂盒包括经标记物标记的BVDVErns蛋白；和或经标记物标记的与BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体；进一步的，所述BVDVErns蛋白为酶标记的蛋白；和或，所述BVDVErns蛋白的单克隆抗体为酶标记的抗体；进一步的，所述酶标记中使用的酶包括辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉、乙酰胆碱酶、无机焦磷酸酶、荧光素酶或过氧化氢酶；进一步的，所述ELISA试剂盒还包括抗原包被板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液。进一步的，所述ELISA试剂盒为阻断ELISA抗体检测试剂盒；所述阻断ELISA抗体检测试剂盒中BVDVErns蛋白作为包被板抗原，所述BVDVErns蛋白的单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的抗体；进一步的，所述试剂盒中阴性对照为BVDVErns阴性的血清。本发明还提供了一种上述BVDVErns蛋白、上述单克隆抗体或上述试剂盒在检测BVDV中的用途。本发明还提供了一种筛选BVDV野生毒株感染的牛的方法，所述方法包括检测牛的血清中是否存在与权利要求2所述的BVDVErns蛋白相结合的抗体；若牛的血清中存在与所述BVDVErns蛋白相结合的抗体，则所述牛为被BVDV野生毒株感染的牛；所述牛经BVDVE2亚单位疫苗免疫；进一步的，所述检测为使用上述试剂盒检测。进一步的，通过ELISA方法检测血清中是否存在与权利要求2所述的BVDVErns蛋白相结合的抗体；其中，ELISA中酶标记的抗体为权利要求3所述的与BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体；进一步的，所述酶标记的抗体为辣根过氧化物酶标记的抗体。进一步的，所述ELISA方法为阻断型ELISA检测方法；进一步的，所述阻断型ELISA检测方法包括如下步骤：将待测样品孵育在包被了BVDVErns蛋白的ELISA反应板中，然后加入所述酶标记的抗体，孵育显色后检测OD450的值，然后根据OD450的值计算样品的阻断率；其中，阻断率在0％-30％的样本为阴性样本；阻断率在35％-100％的样本为阳性样本；阻断率在30％-35％的样本为可疑样本；进一步的，所述阻断率按照如下方法计算：阻断率＝阴性对照的OD平均值-样本的OD平均值阴性对照的OD平均值×100％。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的表达BVDVErns蛋白的表达载体使用昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达，具有安全性高，载体构建周期短和蛋白表达水平高的优点。本发明提供的上述表达载体表达的Erns蛋白，其上有中和表位，产生的中和抗体具有中和BVDV和CSFV的能力。Erns具有结合dsRNA和RNase活性，该活性对抑制dsRNA介导的信号是必需的。因此该蛋白在研究BVDV的实验中是一种十分重要的蛋白。该蛋白还可以通过进一步的修饰应用于多种分子生物学实验中，为BVDV相关的分子生物学实验奠定了物质基础。本发明提供的与上述BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体，该单克隆抗体可以广泛的应用于BVDV的相关研究，为BVDV相关的分子生物学实验奠定了物质基础。本发明提供的试剂盒，该试剂盒包含BVDVErns蛋白和或与BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体，可以应用于多种研究BVDV的分子生物学实验中例如可以应用于免疫印迹、免疫组化、酶联免疫反应或免疫荧光技术中。本发明提供的上述BVDVErns蛋白、与上述BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体或试剂盒在检测BVDV中的用途，该用途广泛，适用于检测BVDV以及BVDV包含的蛋白或是抗BVDV的抗体。本发明提供的筛选BVDV野生毒株感染的牛的方法，可以从经BVDVE2亚单位疫苗免疫的牛中，筛选出感染了BVDV野生毒株的牛。当牛经BVDVE2亚单位疫苗免疫后，牛的血清中会存在结合BVDVE2蛋白的抗体而不存在能够与BVDVErns蛋白相结合的抗体。当牛被BVDV的全病毒感染、或者经全病毒的灭活疫苗免疫后，牛的血清中会存在可以与BVDVErns蛋白相结合的抗体。因此本发明利用这二者之间的差异，即待测样本的血清中是否存在可以与BVDVErns蛋白相结合的抗体，来判断经BVDVE2亚单位疫苗免疫后的牛是否又被BVDV病毒感染。该方法利用分子生物学方法，样本只需采集牛的血清，利用抗原与抗体之间的特异性的反应即可检测出提供该血清的样本是否被BVDV病毒感染，因此该方法具有操作简单并且通量大的优点。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例1提供的表达载体构建的流程图；图2为本发明实施例1提供的扩增的用于构建载体的目的基因；图3为本发明实施例1提供的感染4日的Sf-9昆虫细胞扩增出的目的基因的片段；图4为本发明实施例1中Erns蛋白表达的Western-blot检测结果。具体实施方式下面将结合实施例和附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供了一种表达BVDVErns蛋白的表达载体，所述表达载体表达如SEQIDNO.1所示序列编码的Erns蛋白；所述表达载体为杆状病毒。本发明采用昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达BVDVErns蛋白，杆状病毒属于杆状病毒科Baculoviridae，分为核多角体病毒属和颗粒体病毒属，病毒粒子呈杆状，是一类专一性感染节肢动物并具有囊膜的病毒。杆状病毒可容纳较大片段的外源DNA插入而成为表达大片段DNA的理想载体。在一些优选的实施方式中，所述BVDVErns蛋白由昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达。昆虫细胞杆状病毒表达载体系统Insectcellbaculovirusexpressionvectorsystem，IC-BEVS具有真核表达系统所具有的传统优势，同时兼具原核表达系统重组蛋白表达量高的特点。昆虫细胞杆状病毒表达载体系统具有如下优势：①杆状病毒具有很好的安全性。②该系统与哺乳动物细胞表达系统相比载体构建周期短。③杆状病毒能容纳大分子的插入片段。④杆状病毒表达系统获得重组蛋白高水平的表达。⑤昆虫杆状病毒表达载体系统具有在同一细胞内同时表达多个基因的能力。Erns蛋白是BVDV重要的结构蛋白之一，可以诱导机体产生中和抗体，因此表达系统中对蛋白翻译后的修饰的过程十分重要，如果表达的蛋白缺少翻译后修饰加工，将会使表达的蛋白与天然蛋白存在抗原性差异，并且易形成包涵体。昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达的Erns蛋白可以得到与天然结构相近的蛋白，因而拥有与天然蛋白相似的抗原表位。使用昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达得到的蛋白，诱导机体产生的抗体与天然抗体接近，这样有利于在分子生物学中的实验和应用，可以减少实验误差。本发明还提供了一种上述表达载体表达的BVDVErns蛋白。Erns是BVDV编码蛋白中高保守的蛋白，其上有中和表位，产生的中和抗体具有中和BVDV和CSFV的能力。Erns具有结合dsRNA和RNase活性，该活性对抑制dsRNA介导的信号是必需的。因此该蛋白在研究BVDV的实验中是一种十分重要的蛋白。该蛋白还可以通过进一步的修饰应用于多种分子生物学实验中，例如可用于定型或者定量的检测待测样本中抗BVDVErns蛋白的抗体，例如可作为分子生物学实验中的标准品，例如还可以作为制备抗BVDVErns蛋白的抗体的抗原等，该蛋白为BVDV相关的分子生物学实验奠定了物质基础。本发明还提供了一种与所述BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体，该单克隆抗体可以广泛的应用于BVDV的相关研究，为BVDV相关的分子生物学实验奠定了物质基础，例如可以应用于免疫印迹、免疫组化、酶联免疫反应或免疫荧光技术中。本发明所述所述BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体为使用常规方法得到的抗体，例如使用BVDVErns蛋白免疫小鼠后，然后通过制备杂交瘤细胞得到上述抗体。本发明对该单克隆抗体的制备方法不做限制，只要可以与所述BVDVErns蛋白结合即可。在本发明一些可选的实施方式中，所述BVDVErns蛋白和或所述单克隆抗体经标记物标记。在一些可选的实施方式中，所述标记例如可以为但不限于为荧光标记、酶标记或者生物素标记。在一些可选的实施方式中，所述荧光标记典型但非限制性的使用如下荧光染料标记：Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa555、Alexa647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY630650、BODIPY650665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、CascadeBlue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑、OregonGreen488、OregonGreen500、OregonGreen514、PacificBlue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、LaJolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyaninB、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT四甲基罗丹明异硫醇、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的一种或多种。在一些可选的实施方式中，所述酶标记典型但非限制性的使用如下种类的酶标记：辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉、乙酰胆碱酶、无机焦磷酸酶、荧光素酶或过氧化氢酶中的一种或多种。本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含所述BVDVErns蛋白和或所述与BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体。蛋白与抗体是分子生物学实验中常用的试剂，因此包含了所述BVDVErns蛋白和或所述与BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体的试剂盒具有多种用途，例如可以应用于免疫印迹、免疫组化、酶联免疫反应或免疫荧光技术中。在一些可选的实施方式中，所述试剂盒为ELISA试剂盒；所述ELISA试剂盒包括经标记物标记的BVDVErns蛋白；和或经标记物标记的BVDVErns蛋白的单克隆抗体。例如在一种可选的实施方式中，所述ELISA试剂盒包括用于包被在反应板上的BVDVErns蛋白，和使用酶标记的BVDVErns蛋白的单克隆抗体，该试剂盒可采用竞争法ELISA检测待测样本中的BVDVErns的抗体；又例如在另一种可选的实施方式中，所述ELISA试剂盒包括包括酶标记的BVDVErns蛋白的单克隆抗体，可采用双抗夹心ELISA的方法检测待测样本中的BVDVErns蛋白。在一些可选地实施方式中，所述BVDVErns蛋白为酶标记的蛋白；和或，所述BVDVErns蛋白的单克隆抗体为酶标记的抗体。可选地，所述酶标记中使用的酶例如可以为但不限于为辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉、乙酰胆碱酶、无机焦磷酸酶、荧光素酶或过氧化氢酶。可以理解的是本发明不限制ELISA中酶标记标抗体中酶的种类，只要符合ELISA实验原理即可，优选使用辣根过氧化物酶标记抗体。在一些可选的实施方式中，所述试剂盒还包括抗原包被板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液。在一些可选的实施方式中，所述ELISA试剂盒为阻断ELISA抗体检测试剂盒；所述阻断ELISA抗体检测试剂盒中BVDVErns蛋白作为包被板抗原，所述BVDVErns蛋白的单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的抗体；所述试剂盒还包含阴性对照，所述阴性对照为BVDVErns的抗体阴性血清。本发明还提供了一种上述BVDVErns蛋白、上述BVDVErns的单克隆抗体或上述试剂盒在检测BVDV中的用途。在一些可选的实施方式中，所述用途包括检测待测样本是否被BVDV感染；待测样本经BVDV全病毒灭火疫苗免疫后是否产生抗BVDV的抗体；待测样本中是否存在BVDV的相关抗体等。本发明还提供了一种筛选BVDV野生毒株感染的牛的方法，该方法用于检测经BVDVE2亚单位疫苗免疫的牛是否再次感染BVDV；所述方法包括检测牛的血清中是否存在与所述BVDVErns蛋白相结合的抗体；若牛的血清中存在与所述BVDVErns蛋白相结合的抗体，则所述牛为被BVDV野生毒株感染的牛。当牛经BVDVE2亚单位疫苗免疫后，牛的血清中会存在与BVDVE2蛋白相结合的抗体而不存在能够与BVDVErns蛋白相结合的抗体。当牛被BVDV的全病毒感染、或者经全病毒的灭活疫苗免疫后，牛的血清中会存在可以与BVDVErns蛋白相结合的抗体。因此本发明利用这二者之间的差异，即待测样本的血清中是否存在可以与BVDVErns蛋白相结合的抗体，来判断经BVDVE2亚单位疫苗免疫后的牛是否又被BVDV病毒感染。该方法利用分子生物学方法，样本只需采集牛的血清，利用抗原与抗体之间的特异性的反应即可检测出提供该血清的样本是否被BVDV病毒感染，因此该方法具有操作简单并且通量大的优点。在一些可选的实施方式中，通过ELISA方法检测血清中是否存在与上述BVDVErns蛋白相结合的抗体；其中，ELISA中酶标的抗体为所述的与BVDVErns蛋白相结合的单克隆抗体；所述酶标记的抗体优选为辣根过氧化物酶标记的抗体。在一个优选的实施方式中，所述ELISA方法为阻断型ELISA检测方法。在一些可选的实施方式中，该方法包括如下步骤：将待测样品和阴性对照孵育在包被了BVDVErns蛋白的ELISA反应板中，然后加入所述酶标的抗体，孵育显色后酶标仪检测OD450的值，然后根据OD450的值计算样品的阻断率；其中，阻断率在0％-30％的样本为阴性样本；阻断率在35％-100％的样本为阳性样本；阻断率在30％-35％的样本为可疑样本。在一些优选的实施方式中，所述阻断率按照如下方法计算：阻断率＝阴性对照的OD平均值-样本的OD平均值阴性对照的OD平均值×100％。在一个可选的实施方式中，所述阻断型ELISA检测方法如下所述：包被BVDVErns蛋白0.1μgmL，洗涤封闭后加入待测血清和阴性对照各50μl孔，室温孵育1h，PBST洗涤6次；加入辣根过氧化物酶标记的BVDVErns蛋白的单克隆抗体室温孵育1h，PBST洗涤6次，加底物显色液100μl，室温反应5分钟；各反应孔中加1molL盐酸100μl终止反应。下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果。实施例1载体构建实验材料：试剂：合成的BVDVErns、引物、PfuDNA聚合酶、dNTPs、PCRbuffer、vector、NotI内切酶、感受态细胞、QIAguickPCR纯化试剂盒、LB-kana培养液、BaculoDirectTMBaculovirusExpressionSystem试剂盒、SF900II无血清培养液、Western-blot所需试剂、牛病毒性腹泻Erns阳性血清、FITC标记的兔抗猪的二抗。细胞：Sf-9昆虫细胞购自美国Invitrogen生命技术公司牛病毒性腹泻Erns重组杆状病毒构建方法流程如图1所示。ABVDVErns基因的扩增：BVDVErns基因以合成的如SEQIDNO.1所示序列为模板，用高保真PfuDNA聚合酶扩增其BVDVErns基因，扩增引物包括BacERNS-F1和BacERNS-R1，其中BacERNS-F1具有如SEQIDNO.2所示序列，BacERNS-R1具有如SEQIDNO.3所示序列，引物序列如下所示：BacERNS-F1:5’-CACCATGGTTGGATCCATGAAAATAGTGCCC-3’；BacERNS-R1:5’-TATAAGCTTAGCCGCATATGCTCC-3’。此外，本实施方式中引物在PCR产物的5’端引入了cloningsiteCACC及包含ATG的Kozak转录起始序列ACCATGG。其中PCR详细步骤如下所述：取已合成的BVDVErns为模板，加入引物10μM各1μl，5μldNTPs2.5mM，5μl10×PCRbuffer，1μlPfu聚合酶，36μl双蒸水。先以95℃预变性3分钟，再于94℃变性30秒、57℃退火30秒、72℃延伸1分钟的程序下进行35个循环，最后72℃再延伸10分钟。反应结束后以1.0％琼脂糖凝胶于100伏特电压进行电泳分析，电泳结果如图2所示，其中永道1为基因模板，泳道2为阴性对照，泳道3为DNAMarker2000。目的基因大小约946bp，根据图2可看出成功扩增出目的基因大小的片段。目的片段使用QIAguickTMPCR纯化试剂盒回收，详细步骤参考纯化试剂盒操作手册。纯化后经1.0％琼脂凝胶电泳进行确认后，利用分光光度计在波长260nm测定其OD值，换算回收DNA浓度，-20℃以下冰箱保存备用。B杆状病毒转移载体的构建a克隆反应：试验方法参考Invitrogen操作手册。反应体系如下：0.5-4μl已纯化的blunt-endPCR产物其中包含5-10ngDNA，1μl盐溶液1.2molLNaCl，0.06molLMgCl2，1μl载体，再加入双蒸水使总体积为6μl。混匀后置室温15分钟后，将反应管置冰上，备用。b质粒转化：取2μl步骤a中的cloning反应液加至OneTOP10ChemicallyCompetentE.coliInvitrogen作用管中，轻拍管壁使其混合均匀，冰上放置30分钟，42℃水浴中热击30秒，之后迅速将反应管放回冰上冷却2分钟，然后向反应管中加入已回温的250μlSOC培养液，放入37℃中以转速200rmin振荡培养60分钟。取50μl上述菌液均匀涂抹于LB-kana筛选平板上含50μgmlkanamycin，正面向上放置30分钟，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养箱中培养过夜。cBVDVErns重组转移载体的筛选：通过PCR方法，进行BVDVErns重组转移载体的初步筛选。以无菌10μl白色枪头，在LB-kana筛选平板上挑取24个单克隆，各自接种至1mlLB-kana培养液中，于37℃恒温振荡培养箱中，以转速200rmin振荡培养过夜。首先配制PCR反应液并分装成24管，每管PCR反应液中含BacERNS-F1与BacERNS-R1引物10μM各0.5μl，2.5μldNTPs2.5mM，2.5μl10×PCRbuffer，0.5μlPfuDNA聚合酶，16.5μl双蒸水。2μl菌液作为PCR反应模板。PCR反应流程如前所述。反应后以1.0％琼脂凝胶于100伏特电压进行电泳分析。若出现预期产物，则选取4-5个相对应的菌液，1‰比例接种至3mlLB-Kana培养液中，于37℃恒温振荡培养箱中，以转速200rmin振荡培养过夜。用QIAprepTMSpinPlasmidKit进行重组载体的提取：将3ml菌液以转速10000rmin离心4分钟后，去除上清液，加入250μlbufferP1含RNaseA100mgmL，使菌体悬浮后，将混合液移至1.5ml微量离心管中，再加入250μlbufferP2，并上下翻转数次至液体变透明黏稠，加入350μlbufferN3，缓慢摇晃数次，以转速12000rmin离心10分钟。吸取上清加入QIAprepspincolumn中，以转速12000rmin离心1分钟，丢弃滤液，加入750μlbufferPE至column中以洗去多余盐类，以转速12000rmin离心1分钟，丢弃滤液，再离心2分钟以避免液体残留，最后将column置新的微量离心管中，加入20μl双蒸水，静置1分钟使载体DNA充分溶解，以转速12000rmin离心1分钟，收集滤液，保存于-20℃以下。重组载体经限制内切酶NotI切割后，以1.0％琼脂糖凝胶于100伏特电压进行电泳分析。若与预期产物大小相符，则选取其中2个已提取的重组载体，以vector本身的引物M13FM13R，进行测序验证。d重组转移载体的保存：将含重组转移载体的E.coli菌株接种于5mlLB-kana培养液含50μgmlkanamycin中，置37℃恒温振荡培养箱，以转速200rmin振荡培养16小时，加入20％的甘油，分装，置-70℃以下保存。CLR重组反应重组转移载体经测序验证正确后，将提取的重组载体，用分光度计于波长260nm处测重组载体的核酸浓度。再以《BaculoDirectTMBaculovirμsExpressionSystem》进行LR重组反应。具体操作如下：无菌操作将1μl重组转移载体100-300ng、4μlreactionbuffer及1μl双蒸水分别加入10μlBaculoDirectTMLinearDNA300ng中。自-70℃冰箱中取出LRenzymemix置冰上回温2分钟后，振荡2次，每次2秒，取4μlLRenzymemix加入上述混合液中，轻拍管壁数次使其混合均匀，不可剧烈振荡以免杆状病毒DNA断裂。于25℃感作18小时后，加入2μlProteinaseKsolution，置37℃作用10分钟，中断LR重组反应。D转染取6孔细胞培养板，每孔接种1.5×106个活性良好细胞存活率大于95％的Sf-9细胞，重复2孔。将细胞置26-28℃培养1小时，使细胞完全附着于培养板底部。转染前需先配制下列混合液，转染混合液A：20μlLR重组反应液含已重组的杆状病毒DNA与200μlSF900II无血清昆虫细胞培养液；转染混合液B：12μlreagent与200μlSF900II无血清昆虫细胞培养液。将转染混合液A与B进行混合，轻拍管壁使其混合，置室温感作45分钟。先以SF900II无血清昆虫细胞培养液小心清洗已附着的Sf-9细胞，接着将A、B混合液分成两管，每管各加入800μlSF900II无血清昆虫细胞培养液，上下翻转数次。最后将6孔板中培养液尽量抽干，再沿管壁缓慢加入A、B混合液于2孔中。将细胞培养板密封后，26-28℃培养5小时。抽掉混合液，于每孔中加入3ml含有抗生素与100μMganciclovir的Sf-900ⅡSFM，最后以透明胶带密封，置26-28℃恒温培养箱中培养5日。未重组成功的杆状病毒基因体，具有单纯疱疹病毒的thymidinekinase基因，在添加ganciclovir的培养液中，无法进行DNA的复制，因此减少了未重组的杆状病毒的产生。EBVDVErns重组杆状病毒的收获与鉴定a病毒收获:将病毒液收集至50ml离心管中，以转速3000rmin离心5分钟去除细胞碎片，于病毒液中加入10％胎牛血清，以减少可能存在的蛋白酶对病毒的破坏，之后将病毒液避光保存4℃以下备用，或-70℃以下长期保存。用于转染后初代分离时，以0.45μm的滤膜过滤，再分装于1.5ml离心管中。b病毒鉴定：基因的鉴定：提取感染4日的Sf-9昆虫细胞上清中的DNA，使用引物BacERNS-F1和BacERNS-R1对上清中的DNA进行扩增，结果如图3所示，其中，泳道1为感染的sf9细胞，泳道M为DNAMarker200，泳道2为阴性对照，泳道3为细胞对照，泳道4为阳性对照。从图3可以看出，提取感染的sf9细胞核酸，反转录与PCR扩增后，电泳结果可看出扩增出目的基因大小的片段，感染的sf9细胞内存在目的基因，初步说明感染的sf9为阳性。Erns蛋白表达分析：通过Western-blot验证BVDVErns蛋白的表达及反应原性。首先进行SDS-PAGE，然后将SDS-PAGE胶上的蛋白条带转移到PVDF膜上，置含5％的脱脂奶粉的PBST中，室温封闭30分钟，清洗5次，加入一抗BVDVErns阳性血清，室温作用1小时，清洗5次，加入含辣根过氧化物酶标记的兔抗猪的二抗，室温作用1小时，清洗5次，于暗室内进行DAB显色。结果如图4所示，其中，泳道1为细胞对照，泳道2为表达的蛋白，泳道M为蛋白Marker。由图4可以看出，蛋白表达进行western-blot检测，结果显示出现预期约35kDa的条带，说明表达的蛋白具有反应原性。免疫荧光：将构建好的BVDVErns重组杆状病毒接种于Sf-9细胞，置26-28℃恒温培养箱中培养7日，7日后每孔用PBST洗6次，然后加入100μl甲醛，固定10分钟，加入一抗BVDVErns阳性血清1︰1000，感作1小时，加入FITC标记的兔抗猪的IgG二抗，于倒置荧光显微镜下观察有无荧光信号。实施例3为阻断型ELISA筛选BVDV野生毒株感染的牛的方法该方法包括如下步骤：将BVDVErns蛋白0.1μgmL包被于ELISA反应板，洗涤封闭后加入待测血清样本各50μl孔，室温孵育1h，PBST洗涤3-6次，加入辣根过氧化物酶标记的BVDVErns蛋白的单克隆抗体室温孵育1h，PBST洗涤6次，加底物显色液100μl，室温反应5分钟；各反应孔中加1molL盐酸100μl终止反应。其中各待测样品包括如下样品：免疫BVDV灭活疫苗全病毒的牛血清；感染BVDV全病毒的牛血清；免疫E2亚单位疫苗的牛血清；猪瘟病毒Erns抗体阳性血清。将反应板置于酶标仪中检测各反应孔的OD450的值，计算阻断率；阻断率按照如下公式计算：阻断率＝阴性对照的OD平均值-样本的OD平均值阴性对照的OD平均值×100％。阻断率在0％-30％的样本为阴性样本；阻断率在35％-100％的样本为阳性样本；阻断率在30％-35％的样本为可疑样本；其结果如下：免疫BVDV灭活疫苗全病毒的牛血清中Erns抗体阳性的阳性率为93.7％；感染BVDV全病毒的牛血清中Erns抗体阳性的阳性率为100％；免疫E2亚单位疫苗的牛血清Erns抗体阳性的阳性率为0％；猪瘟病毒Erns抗体阳性血清Erns抗体阳性的阳性率为0％。实施例4筛选BVDV野生毒株感染的牛的方法的应用在未免疫前筛选采集200份牛血清，包被纯化后Erns蛋白0.1μgmL，洗涤封闭后加入待测血清50μl孔，室温孵育1h，PBST洗涤6次；加入酶标记单抗，室温孵育1h，PBST洗涤6次，加底物显色液100μl，室温反应5分钟；各反应孔中加1molL盐酸100μl终止反应。Erns抗体阳性率为15.5％，将Erns抗体阴性的牛隔离饲养，其中80头免疫牛病毒性腹泻粘膜病毒灭活疫苗全病毒，80头免疫牛病毒性腹泻粘膜病毒E2亚单位疫苗，另9头不免疫，35天后采血测Erns抗体，按上述方法进行检测，免疫牛病毒性腹泻粘膜病毒灭活疫苗全病毒Erns抗体阳性率93.7％，攻毒后检出率100％；免疫牛病毒性腹泻粘膜病毒E2亚单位疫苗、不免疫组牛Erns抗体阳性率0％，攻毒后检出率100％，证明了该检测方法具有良好的敏感性和特异性，可用于检测牛病毒性腹泻粘膜病毒Erns抗体，可用于筛选BVDV野生毒株感染的牛。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。SEQUENCELISTING110天康生物股份有限公司120BVDVErns蛋白和抗体及筛选BVDV感染的牛的方法1603170PatentInversion3.52101211921212DNA213人工序列4001atgaaaatagtgcccaaagagtctgagaaagacagcaagactaaaccgccagatgctacg60atagtggtagatggagttaaataccaggtaaagaagaagggaaaagtcaagagtaaaaat120acgcaggacggtttatatcataacaaaaataagccgccagaatcacgcaagaaactagag180aaagcattattggcatgggcaatattggctgcagtcttgattcaagttacaatgggtgaa240aatataacacagtggaacctacaggataatgggacagaagggatacaacgggcaatgttc300caaaggggggtgaacagaagtctacacgggatctggccaggaaaaatctgtacaggtgtc360ccttcccatctagccaccgatatggaactaaaaacgatccatggtatgatggatgcaagt420gaaaagaccaactatacgtgttgcagacttcaacgccatgagtggaacaagcatggttgg480tgcaactggtacaatattgaaccttggattttactcatgaatagaacccaagccaatctt540actgagggtcaaccaccaagagaatgcgcggtcacttgtaggtatgatagagatagtgat600ctgaatgtggtaacacaagctagagatagccccacaccattgacaggctgtaagaaaggg660caaaatttttcttttgcaggcatattgatgcggggtccctgcaacttcgaaatagctgcg720agcgatgtgttgttcaaagaagatgaatgcaccagcatgtttcaggatactgcgcattac780ctcgttgacgggatgaccaattccctggaaagtgccagacaagggaccgctaaactgacg840acctggttaggcaagcagcttgggatactaggaaaaaaattggaaaacaagagcaagaca900tggtttggagcatatgcggct921210221131212DNA213人工序列4002caccatggttggatccatgaaaatagtgccc31210321124212DNA213人工序列4003tataagcttagccgcatatgctcc24

权利要求：1.一种表达BVDVErns蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体表达如SEQIDNO.1所示序列编码的Erns蛋白；所述表达载体为杆状病毒；优选地，所述BVDVErns蛋白由昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达。2.一种权利要求1所述的表达载体表达的BVDVErns蛋白；优选地，所述BVDVErns蛋白经标记物标记；优选地，所述标记包括荧光标记、酶标记或生物素标记。3.一种与权利要求2所述的BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体；优选地，所述单克隆抗体经标记物标记；优选地，所述标记包括荧光标记、酶标记或生物素标记。4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的BVDVErns蛋白和或权利要求3所述的单克隆抗体。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA试剂盒；所述ELISA试剂盒包括经标记物标记的BVDVErns蛋白；和或经标记物标记的与BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体；优选地，所述BVDVErns蛋白为酶标记的蛋白；和或，所述BVDVErns蛋白的单克隆抗体为酶标记的抗体；优选地，所述酶标记中使用的酶包括辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉、乙酰胆碱酶、无机焦磷酸酶、荧光素酶或过氧化氢酶；优选地，所述ELISA试剂盒还包括抗原包被板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒为阻断ELISA抗体检测试剂盒；所述阻断ELISA抗体检测试剂盒中BVDVErns蛋白作为包被板抗原，所述BVDVErns蛋白的单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的抗体；优选地，所述试剂盒中阴性对照为BVDVErns阴性的血清。7.一种权利要求2所述的BVDVErns蛋白、权利要求3所述的单克隆抗体或权利要求4-6中任一项所述的试剂盒在检测BVDV中的用途。8.一种筛选BVDV野生毒株感染的牛的方法，其特征在于，所述方法包括检测牛的血清中是否存在与权利要求2所述的BVDVErns蛋白相结合的抗体；若牛的血清中存在与所述BVDVErns蛋白相结合的抗体，则所述牛为被BVDV野生毒株感染的牛；所述牛经BVDVE2亚单位疫苗免疫；优选地，所述检测为使用权利要求4-6中任一项所述的试剂盒检测。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过ELISA方法检测血清中是否存在与权利要求2所述的BVDVErns蛋白相结合的抗体；其中，ELISA中酶标记的抗体为权利要求3所述的与BVDVErns蛋白结合的单克隆抗体；优选地，所述酶标记的抗体为辣根过氧化物酶标记的抗体。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述ELISA方法为阻断型ELISA检测方法；优选地，所述阻断型ELISA检测方法包括如下步骤：将待测样品孵育在包被了BVDVErns蛋白的ELISA反应板中，然后加入所述酶标记的抗体，孵育显色后检测OD450的值，然后根据OD450的值计算样品的阻断率；其中，阻断率在0％-30％的样本为阴性样本；阻断率在35％-100％的样本为阳性样本；阻断率在30％-35％的样本为可疑样本；优选地，所述阻断率按照如下方法计算：阻断率＝阴性对照的OD平均值-样本的OD平均值阴性对照的OD平均值×100％。

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