申请/专利权人：扬州大学

申请日：2022-09-19

公开（公告）日：2023-04-04

公开（公告）号：CN115896171A

主分类号：C12N15/85

分类号：C12N15/85;C12N15/40;C12N15/53;C12N7/01;C12Q1/02;C12Q1/18;C12Q1/66;C12R1/93

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的撤回

法律状态：2023.09.19#发明专利申请公布后的撤回;2023.04.21#实质审查的生效;2023.04.04#公开

摘要：本发明涉及一株稳定表达分泌型荧光素酶Gluc的GI型日本脑炎病毒重组毒及其构建方法与应用，利用同源重组技术，将JEV基因组cDNA分四个片段一次性克隆至低拷贝质粒pOK‑12中，并在病毒基因组全长的上游和下游分别添加T7启动子和丁型肝炎病毒的HDVR序列，从而获得GI型JEV的感染性cDNA克隆质粒pOK‑rGI；将一段Gluc‑T2A‑C34基因序列SEQIDNO.2插入到病毒基因组中，即可获得携带有Gluc基因的重组病毒感染性cDNA克隆质粒pOK‑rGI‑Gluc。以线性化的感染性克隆质粒为模板，利用体外转录技术获得重组病毒的基因组RNA全长，并将RNA转染至BHK‑21细胞中，待细胞出现典型细胞病变时，即可获得表达Gluc蛋白的重组病毒rGI‑Gluc。该重组病毒具有遗传稳定型，感染细胞后能够分泌表达Gluc蛋白到细胞上清中，便于病毒的检测。

主权项：1.一株稳定表达分泌型荧光素酶Gluc的GI型日本脑炎病毒重组毒的cDNA感染性克隆的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）、选择载体为pOK-12低拷贝载体，将HDVR序列SEQIDNO.1由人工合成，并克隆至低拷贝质粒pOK-12的NotI和SalI酶切位点之间，得到重组质粒pOK12-HDVR；（2）、以GI型JEV毒株YZ-1的RNA逆转录产物cDNA为模板，利用四对引物F1-F与F1-R，F2-F与F2-R，3-F与F3-R，F4-F与F4-R扩增出涵盖病毒基因组全长的四个DNA片段，分别为F1，F2，F3和F4；即，利用引物F1-F与F1-R扩增出片段F1，引物F2-F与F2-R扩增出片段F2，引物F3-F与F3-R扩增出片段F3，引物F4-F与F4-R扩增出片段F4；F1片段5′端具有T7启动子序列，以及与线性化载体pOK12-HDVR间具有20bp的同源臂序列；此外，四个片段间以及F4片段与线性化载体pOK12-HDVR间也均具有同源臂序列；其中：F1-F引物为：TATGGAAAAACGGCTTTGGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGAGAAGTTTATCTGTGTGAACTTCTT；F1-R引物为：TTGTGTGATCCAAGACATTCCCCCAAAGAG；F2-F引物为：TTTGGGGGAATGTCTTGGATCACACAA；F2-R引物为：TGGAACACCGGGATCATCAATCAAGTGAAA；3-F引物为：TTTCACTTGATTGATGATCCCGGTGTTCCA；F3-R引物为：GGCTTGTCAGCGTTCTTGATGAGAGTCCA；F4-F引物为：TGGACTCTCATCAAGAACGCTGACAAGCC；F4-R引物为：TGGAGATGCCATGCCGACCCAGATCCTGTGTTCTTCCTCACCACCAGCTACA；（3）、利用同源重组技术将片段F1，F2，F3和F4插入到载体pOK12-HDVR中，获得重组质粒pOK-rGI；具体为：将载体pOK12-HDVR利用限制性内切酶NotI进行线性化处理，将步骤（2）中的F1，F2，F3，F4片段与线性化的质粒pOK12-HDVR进行同源重组，得到重组质粒pOK-rGI；（4）、以质粒pOK-rGI为模板，利用引物F1-F与C34-R扩增出片段A，利用引物C34-F与Gluc-SacII-R扩增出片段C；片段B由人工合成，片段B的序列如SEQIDNO.2；质粒pOK-rGI利用限制性内切酶NotI与SacII进行线性化处理，进一步将线性化处理的载体与A，B，C片段混合进行同源重组，从而将片段Gluc-T2A-C34插入到JEV基因中，获得重组质粒pOK-rGI-Gluc；其中：C34-R引物为：TTTGACTCCCATCCCGGAAACTACCCTCTTCACTCCCA；C34-F引物为：GTGAAGAGGGTTGTAATGAGCTTGTTGGACGGCAGAGGGCCAG；Gluc-SacII-R引物为：CTTCCTTTCCCGAAAAGTCCACATCCATTTC。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 扬州大学 一株稳定表达分泌型荧光素酶Gluc的GI型日本脑炎病毒重组毒及其构建方法与应用

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