申请/专利权人：武汉中帜生物科技股份有限公司

申请日：2019-12-19

公开（公告）日：2023-06-27

公开（公告）号：CN110923344B

主分类号：C12Q1/689

分类号：C12Q1/689;C12Q1/6813;C12Q1/14;C12N15/11;C12R1/445

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.06.27#授权;2020.04.21#实质审查的生效;2020.03.27#公开

摘要：本发明公开了金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA检测试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物‑‑‑特异探针‑‑‑金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。本发明没有RNA的提取过程，不需要特殊仪器，基于RNA恒温扩增，在实际检测中不易污染，灵敏度高、特异性强以及操作简单，使金黄色葡萄球菌及耐药基因mecA核酸检测得到广泛应用成为一种可能。

主权项：1.一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1扩增反应液：含40mMpH8.0的Tris-HCl，12mMMgCl2，70mMKCl，15％DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM；其中扩增引物包括三对：金黄色葡萄球菌、甲氧西林耐药基因mecA、和人内参基因，具体扩增引物如下：1金黄色葡萄球菌的扩增引物：SA-R引物5’-3’：TAATACGACTCACTATAGGGAGACGCTTTAATTAATGTCGC；SA-F引物5’-3’：CAAATGCATCACAAACAG；2甲氧西林耐药基因的扩增引物：mecA-R引物5’-3’：TAATACGACTCACTATAGGGAGATGAAGCAACCATCGTTAC；mecA-F引物5’-3’：CTACAATGCCAAAATCTC；3内参基因的扩增引物：内参-R引物5’-3’：TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAACTTTAATATACGCT；内参-F引物5’-3’：AGGCCCTGTAATTGGAAT；2扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7RNA聚合酶和RnaseH；3细胞裂解液；4检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸金探针、每个指标的特异探针、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：1金黄色葡萄球菌特异探针：SA-CES15’-3’：ATAACGGCGTAAATAGttttACTTGGCTACGTAGCTACGT；SA-CES25’-3’：AAGTGGTTCTGAAGATttttACTTGGCTACGTAGCTACGT；SA-LES15’-3’：CCAACAGTATATAGTGtttttACAGTACAGCCTGACACCTAGCT；SA-LES25’-3’：CAACTTCAACTAAAAAtttttACAGTACAGCCTGACACCTAGCT；SA-LES35’-3’：ATTACATAAAGAACCTtttttACAGTACAGCCTGACACCTAGCT；2耐甲氧西林基因特异探针：mecA-CES15’-3’：AGGTAAAGTGTATGATttttTAGTCGTATTAGTAGCA；mecA-CES25’-3’：GAGCTATATGAGAACGttttTAGTCGTATTAGTAGCA；mecA-LES15’-3’：GTAATAAAAAATACGAtttttACAGTACAGCCTGACACCTAGCT；mecA-LES25’-3’：TATAGATGAATAACAAtttttACAGTACAGCCTGACACCTAGCT；mecA-LES35’-3’：AACAGTGAAGCAATCCtttttACAGTACAGCCTGACACCTAGCT；3内参特异探针：内参-CES15’-3’：GAGTCCACTTTAAATCttttGCTTGTACATCGGATGAC；内参-CES25’-3’：CTTTAACGAGGATCCAttttGCTTGTACATCGGATGAC；内参-LES15’-3’：TTGGAGGGCAAGTCTGtttttACAGTACAGCCTGACACCTAGCT；内参-LES25’-3’：GTGCCAGCAGCCGCGGtttttACAGTACAGCCTGACACCTAGCT；内参-LES35’-3’：TAATTCCAGCTCCAATtttttACAGTACAGCCTGACACCTAGCT；4C线显色探针5’-3’CTCACTACAGCATAGCGAGCTttttACAGTACAGCCTGACACCTAGCT5金探针金探针5’端被巯基化修饰，所述序列为：5’-CATACTCTGTCTACGTACTGGTAGCTATCAATTTTAGCTAGGTGTCAGGCTGTACTGT-3’5检测卡：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、NC膜、吸水纸；NC膜上有质控线C线和三条检测线T线，从样品垫到吸水纸方向分别为mecA-T、SA-T、内参-T和C线；mecA-T处包被mecA被探针、SA-T处包被SA包被探针、内参-T处包被内参包被探针、C线处包被C线包被探针，具体序列为：mecA包被探针5’-3’：TGCTACTAATACGACTAttttTGCTACTAATACGACTA；SA包被探针5’-3’：ACGTAGCTACGTAGCCAAGTttttACGTAGCTACGTAGCCAAGT；内参包被探针5’-3’：GTCATCCGATGTACAAGCttttGTCATCCGATGTACAAGC；C线包被探针5’-3’：AGCTCGCTATGCTGTAGTGAGttttAGCTCGCTATGCTGTAGTGAG。

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