申请/专利权人：河西学院;临泽县怡泉新禾农业科技发展有限公司

申请日：2023-04-27

公开（公告）日：2023-08-25

公开（公告）号：CN116642993A

主分类号：G01N30/90

分类号：G01N30/90

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.09.12#实质审查的生效;2023.08.25#公开

摘要：本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种从富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取及测定硒蛋白的方法，经20L生物培养罐对荷叶离褶伞进行发酵培养的荷叶离褶伞菌丝体，放入真空干燥箱中进行干燥，磨粉过100目筛制成标准粉，称取0.5g该标准粉，加入浓度为0.05molLNaOH溶液，用超声辅助提取后，在3000rmin转速下离心15min，然后调节上清液至等电点，再次离心得蛋白沉淀，最后将蛋白沉淀放在冷冻干燥机中干燥得蛋白样品。本发明致力于以富硒的荷叶离褶伞菌丝体为原料，采用超声提取，对其硒蛋白的提取工艺进行最佳优化，并对蛋白质中硒的含量进行定量分析，通过薄层色谱试验，检测富硒前后的氨基酸种类和数量的变化，了解硒对荷叶离褶伞菌丝体中氨基酸的影响。

主权项：1.一种从富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取及测定硒蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：通过20L生物培养罐对荷叶离褶伞进行富硒发酵培养，得到富硒荷叶离褶伞菌丝体；步骤2：将步骤1得到的富硒荷叶离褶伞菌丝体放入真空干燥箱中进行干燥；步骤3：将步骤2得到的干燥富硒荷叶离褶伞菌丝体进行磨粉，并过目筛制成100目标准粉；步骤4：称取0.5g步骤3制得的标准粉，加入浓度为0.05molLNaOH溶液，在提取时间20-60min、料液比1:100-1:400、提取温度为40-80℃的条件下进行超声提取1-4次；步骤5：经步骤4提取后，在3000rmin转速下离心15min，得到上清液；步骤6：将步骤5得到的上清液的pH值调节至等电点，再次离心得含硒蛋白沉淀；步骤7：将步骤6得到的含硒蛋白沉淀放在冷冻干燥机中干燥得含硒蛋白样品；步骤8：根据吸光度对硒含量绘制标准曲线，由硒标准曲线计算，测定每克富硒菌丝体中的硒含量和蛋白含量；步骤9：称取步骤7提取的蛋白质0.1g置于水解管中，加入10～15mL6molL的盐酸，将封口严密的水解管放在110±1℃的恒温干燥箱内水解22h后，取出冷却；步骤10：将步骤9冷却后的水解管打开，将水解液全部转入25mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，取滤液1mL置于25mL小烧杯中，在40～50℃的真空干燥箱中烘干，如有残留物，用1～2mL去离子水溶解，再干燥，加入5mL0.02molL的盐酸溶液溶解作为待测液；步骤11：用薄层色谱方法TLC测定步骤10得到的待测液，对富硒菌荷叶离褶伞菌丝体蛋白质中的氨基酸进行定性分析；步骤12：对步骤10得到的待测液中的氨基酸进行定量分析，具体步骤如下：将迁移率值差距大的标品各取1mL混合在一起，用微量进样器取混合标品10μL，富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取的蛋白质水解液和未富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取的蛋白质的水解液20μL，分次点样，每次用冷热风交替吹干，层析后根据面积比计算出氨基酸的含量。

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