申请/专利权人：华电金沙江上游水电开发有限公司叶巴滩分公司;华中农业大学

申请日：2023-03-17

公开（公告）日：2023-09-05

公开（公告）号：CN116694554A

主分类号：C12N5/071

分类号：C12N5/071;A01N1/02

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.09.22#实质审查的生效;2023.09.05#公开

摘要：本发明公开了一种石爬鮡肝脏细胞分离、培养和冷冻保存方法，适用于生物工程技术领域，选健康石爬鮡进行解剖，无菌条件下取出肝脏于HM培养基中，清洗三次后切成块状，胰蛋白酶消化后经细胞筛过滤获得细胞悬液，显微镜下计数后，以一定浓度接种到24孔细胞培养板中，加入DM培养基进行培养；随后，采用冷冻保存剂对培养的肝脏细胞进行液氮冻存，得到石爬鮡肝脏细胞最佳保存体系。本发明采用的石爬鮡肝脏细胞培养方法可重复性强，效果佳；本发明建立了稳定的肝脏细胞原代培养体系，使用特殊的培养基，提高了所提取肝脏原代培养细胞的活力，为进一步开展石爬鮡肝脏功能研究提供细胞模型，并且对石爬鮡的保育具有重要的现实意义。

主权项：1.一种石爬鮡肝脏细胞分离、培养和冷冻保存方法，其特征在于：包括下述步骤：1用HM培养基将健康石爬鮡的新鲜肝脏0.1-1.0mm的组织块清洗干净；2向组织块中加入含有0.1-1mMEDTA的HM培养基，轻轻摇动混匀后静置至组织块沉于底部，吸除培养基；3向组织块中加入含100-1000unitmlCollagenaseIV和0.01-0.1mgmlDNaseII的HM培养基，28℃水浴消解15-60分钟；4移除含CollagenaseIV和DNaseII的HM培养基，加入HM培养基，使用移液管吹打，将肝细胞吹散；5利用22-100μM孔径滤网将未吹散的细胞过滤分离除去，收集打散分离的细胞；6200-1000rpm4℃离心5-10min收集肝脏细胞，使用吸管移除上清培养基，加入10-50mlDM培养基重悬细胞；7吸取10-50μl细胞悬液，加入10-100μl台酚蓝染色细胞，然后显微镜下计数细胞；8使用DM培养基将细胞稀释至1.0-5.0×106cellsml，向直径35mm的培养盘中接种1.0-5.0×106细胞，28℃，5％CO2培养箱中培养细胞6-36小时；9使用冷冻保存剂将密度为2.0×106cellsml的石爬鮡细胞进行梯度降温后，冻存于液氮中保存。

全文数据：

权利要求：

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