申请/专利权人:四川垣吉生物科技有限公司
申请日:2022-07-26
公开(公告)日:2023-09-29
公开(公告)号:CN116813791A
主分类号:C07K19/00
分类号:C07K19/00;C12Q1/6869;C12N15/81;C12N1/19;C12Q1/18;C12N15/11;C12R1/84
优先权:
专利状态码:在审-实质审查的生效
法律状态:2023.10.20#实质审查的生效;2023.09.29#公开
摘要:本发明公开一种天蚕素与蜂毒素杂合抗菌肽合成及测定方法,包括步骤一、CA‑MLT和CB‑MLT杂合抗菌肽的合成,步骤二、双酶切重组验证和测序并进行电转化得到阳性转化子,步骤三、阳性转化子的接种培养和诱导表达处理,步骤四、重组杂合抗菌肽的SDS‑PAGE分析,步骤五、对重组杂合抗菌肽进行抗菌活性和抗菌谱测定及热稳定性和酸碱稳定性测试;本发明合成的杂合抗菌肽具有与蓝本天蚕素A及天蚕素B和峰毒素相似或更高的活性,经本发明的方法测定,杂合抗菌肽抑菌效果强,稳定性高,毒副作用降低,溶血性降低,为细菌病害的预防和治疗提供一种可靠的抗生素的替代品。
主权项:1.一种天蚕素与蜂毒素杂合抗菌肽合成及测定方法,其特征在于包括以下步骤:步骤一、根据基因库中天蚕素A和天蚕素B成熟肽段以及蜂毒素成熟肽段的氨基酸序列,参照毕赤酵母的偏爱密码子及F1、F2和F3三组引物合成杂合肽核苷酸序列,得到CA-MLT和CB-MLT杂合抗菌肽;步骤二、将合成好的CA-MLT和CB-MLT杂合抗菌肽基因分别进行双酶切重组验证并测序,将测序正确的重组质粒进行电转化PichiapastorisX-33得到阳性转化子;步骤三、将筛选的阳性转化子进行接种培养并进行诱导表达处理,然后在28℃、220rmin条件下培养处理后的阳性转化子48h,再用离心机以12000rmin离心15min收集上清液,用透析袋将上清液浓缩10倍,并通过考马斯亮蓝法测定粗蛋白浓度;步骤四、采用改进型LaemmliSDS-PAGE,并以2×SDS作为电泳缓冲液对重组杂合抗菌肽的SDS-PAGE进行分析;步骤五、对重组杂合抗菌肽进行抗菌活性和抗菌谱进行测定,再对重组杂合抗菌肽的热稳定性和酸碱稳定性进行测试。
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权利要求:
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