申请/专利权人：山东大学

申请日：2022-04-14

公开（公告）日：2023-09-29

公开（公告）号：CN114790470B

主分类号：C12P19/32

分类号：C12P19/32;C12N15/54;C12N15/70;C12R1/19

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.09.29#授权;2022.08.12#实质审查的生效;2022.07.26#公开

摘要：本发明涉及一种固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’‑cGAMP的方法。包括构建重组菌mcGAS、重组菌GMK和重组菌NDK，制备cGAS固定化树脂、GMK固定化树脂和NDK固定化树脂，再通过固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’‑cGAMP。本发明通过鼠源核苷转移酶cGAS，金黄色葡萄球菌鸟苷酸激酶GMK和大肠杆菌核苷二磷酸激酶NDK多酶偶联反应高效合成了2’3’‑cGAMP，产量达到了179.8mg，总产率达到了41.2％，仅仅使用ATP和GMP作为底物，在不需要额外添加外源DNA就实现了2’3’‑cGAMP的大规模生产，有效地降低了2’3’‑cGAMP的成本。

主权项：1.一种固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’-cGAMP的方法，其特征在于，包括步骤如下：（1）以鼠源核苷转移酶cGAS基因为模板进行PCR扩增，得到tNmcGAS基因序列；然后将tNmcGAS基因序列插入至载体质粒pET28a-SUMO中，得到pET28a-Sumo-mcGAS重组质粒；（2）将金黄色葡萄球菌鸟苷酸激酶GMK基因插入至载体质粒pET28a中，得到pET28a-GMK重组质粒；（3）将大肠杆菌核苷二磷酸激酶NDK基因插入至载体质粒pET28a中，得到pET28a-NDK重组质粒；（4）将步骤（1）~（3）得到的pET28a-Sumo-mcGAS重组质粒、pET28a-GMK重组质粒和pET28a-NDK重组质粒分别转化至大肠杆菌感受态细胞中，验证并挑选阳性重组子，得到重组菌mcGAS、重组菌GMK和重组菌NDK；（5）分别培养重组菌mcGAS、重组菌GMK和重组菌NDK，经诱导、裂解和离心后，分别得到重组菌mcGAS、重组菌GMK和重组菌NDK的上清液；然后将上清液分别固定至树脂上，得到cGAS固定化树脂、GMK固定化树脂和NDK固定化树脂；其中，所述树脂为Ni或Co螯合的凝胶树脂；所述上清液和树脂的体积比为1000：（1.5~5）；所述固定的条件为4℃，25~35min；（6）以ATP和GMP为底物，在cGAS固定化树脂、GMK固定化树脂和NDK固定化树脂下共孵育10~15h，将孵育产物进行分离纯化后，得到第二信使分子2’3’-cGAMP。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 山东大学 一种固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’-cGAMP的方法

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