申请/专利权人：武汉科前生物股份有限公司

申请日：2021-08-23

公开（公告）日：2023-10-03

公开（公告）号：CN113846112B

主分类号：C12N15/34

分类号：C12N15/34;C12N15/70;A61K39/235;A61K39/12;A61P31/14

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.10.03#授权;2022.01.14#实质审查的生效;2021.12.28#公开

摘要：本发明提供了核苷酸序列、fiber2蛋白及表达方法、鸭3型腺病毒和鸭坦布苏病毒二联灭活疫苗。核苷酸序列，用于编码鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2蛋白，其核苷酸序列如SEQNO：2所示，鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2蛋白的氨基酸序列如SEQNO：3所示；将fiber2蛋白基因片段和pET‑32a载体片段通过T4DNA连接酶连接，得pET‑32a‑fiber2重组表达载体，然后转化至表达菌株E.coliBL‑21DE3感受态细胞培养，从培养物中获得所述的fiber2蛋白，鸭3型腺病毒和鸭坦布苏病毒二联灭活疫苗，其使用的抗原包鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2蛋白和灭活的鸭坦布苏病毒；在二联灭活疫苗中两种抗原的体积比为1：1，鸭坦布苏病毒为鸭坦布苏病毒DF2株，其保藏编号为CCTCCNO：V201635。

主权项：1.鸭3型腺病毒和鸭坦布苏病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.根据基因片段SEQIDNO.1对密码子进行优化，调整基因中的低频及稀有密码子，增加高频密码子的使用，使基因的CAI值由0.70提高到0.96，调整基因片段SEQIDNO.1局部的高GC或AT含量区，消除基因片段SEQIDNO.1中存在的重复及反向重复序列，设计出基因片段SEQIDNO.2，根据基因片段SEQIDNO.2设计所述的一对引物fiber-2（opt）-Ffiber-2（opt）-R进行PCR反应，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化得到fiber2蛋白基因片段；一对引物的序列为：fiber-2（opt）-F：ggatccATGAAACGTACCAACCGTAGCG；fiber-2（opt）-R：ctcgagGAAACATATGAAAACGGAATTGGAC；其中一对引物中划线部分的序列分别为BamHI和XhoI酶切位点；将fiber2蛋白基因片段和pET-32a载体片段通过T4DNA连接酶连接，获得pET-32a-fiber2重组表达载体；将pET-32a-fiber2重组表达载体转化至表达菌株E.coliBL-21（DE3）感受态细胞，获得重组表达菌株；培养重组表达菌株，从培养物中获得所述的fiber2蛋白;将表达纯化的所述fiber2蛋白用灭菌PBS稀释至蛋白浓度为200µgml；步骤2.在所述鸭坦布苏病毒DF2株的病毒液中加入甲醛溶液，使甲醛溶液终浓度为0.2%，边加边搅拌，使其充分混合，置37℃条件下灭活24小时，病毒液中病毒含量为107.5TCID500.1ml;所述鸭坦布苏病毒为鸭坦布苏病毒DF2株，其保藏编号为CCTCCNO：V201635；步骤3.将稀释好的fiber2蛋白和灭活完全的鸭坦布苏病毒液按1:1体积比进行混合，取混合后的96份抗原液，加入4份灭菌的吐温80，搅拌20~30分钟，直到吐温80完全溶解，即为制苗用的水相；将2份油相注入，慢速搅拌同时缓缓加入1份水相，加完后进行剪切乳化；乳化好的疫苗定量分装，加盖密封，贴标签，置2~8℃保存。

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