申请/专利权人：宁夏医科大学

申请日：2021-11-30

公开（公告）日：2023-10-27

公开（公告）号：CN114107300B

主分类号：C12N15/113

分类号：C12N15/113;C12N15/70;C12Q1/6858

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.10.27#授权;2022.05.27#实质审查的生效;2022.03.01#公开

摘要：本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性点突变的crRNA，本发明以MDR‑TB利福平耐药性点突变rpoBL378D为检测靶位点，设计并合成靶向该目的序列的crRNA；构建基于CRISPRCas的MDR‑TB利福平耐药性点突变检测手段，通过联合等温扩增技术和荧光报告子检测手段，实现快速、简便、低廉、高特异性、高灵敏度和可视化的核酸检测优势。本发明旨在开发结核病耐药性点突变检测平台，为TB的预防和治疗提供帮助，具有推广应用的价值。

主权项：1.一种基于CRISPR-Cas技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性点突变的crRNA的制备方法，其特征在于，所述crRNA的序列为：5`-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAUCCGCUCGCCGACCGUACGCAGGCG-3`，所述crRNA的制备方法包括以下步骤：S1：引物合成：以利福平耐药性基因rpoB为靶向检测突变点设计crRNA；首先合成crRNA的转录模板DNA，模板链5’端添加T7启动子5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG，非模板链5’端添加骨架序列5’-TAATTTCTACTAAGTGTAGAT-3’，序列合成并插入Topo载体；所述引物合成包括以下步骤：S1.1合成crRNA的转录模板DNA，其中模板链5’端添加T7启动子5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG，非模板链5’端添加骨架序列5’-TAATTTCTACTAAGTGTAGAT-3’，序列两端插入HindIII和BamHI粘性末端；S1.2：引物退火：crRNA转录模板DNA进行100℃热变性5min，1min降低3℃的速度降至室温，获得退火后的双链，稀释该双链DNA至10μM备用；S1.3：pET28a质粒酶切反应：BamHI、HindIII、10XQuickCutBuffer、pET28a、灭菌水在37℃条件下反应30min，而后在90℃条件下反应10min；S1.4：2%琼脂糖凝胶电泳检测；S1.5：使用胶回收试剂盒回收pET28a酶切片段；S1.6：连接反应：T4DNA连接酶、T4DNA连接酶缓冲液、pET28a胶回收片段、crRNA转录模板、灭菌水在16℃反应1h；S1.7：转化：将上述步骤S6中的反应液10μL全部加至50μL感受态细胞中，冰上放置30min；42℃热激90s，冰上放置3-5min；PCR管中加入600μL新鲜的LB培养液，混合均匀，取200μL涂布于含100μgmL卡那霉素的LB固体平板；37℃倒置培养12-14h；挑取单克隆加入10mL新鲜的含100μgmL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r.p.m.培养14-16h；取700μL菌液测序；所述步骤S1.3中：BamHI为3μL、HindIII为3μL、10XQuickCutBuffer为5μL、pET28a为10μL、灭菌水为29μL，终体积为50μL；S2：crRNA转录：40μL转录体系包括20μLNTPBufferMix、1μg的crRNA-Topo载体、4μL的T7RNA聚合酶Mix，无RNase水定容，37℃恒温孵育16h；S3：crRNA纯化：利用MonarchRNA纯化试剂盒,对体外转录的crRNAs进行纯化。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 宁夏医科大学 基于CRISPR-Cas技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性点突变的crRNA

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