申请/专利权人：勃林格殷格翰动物保健美国公司;根茨美公司

申请日：2017-01-13

公开（公告）日：2024-01-16

公开（公告）号：CN108697813B

主分类号：A61K48/00

分类号：A61K48/00;C12N15/86

优先权：["20160113 US 62/278,243"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.01.16#授权;2018.11.16#实质审查的生效;2018.10.23#公开

摘要：本公开涉及重组病毒载体、包含此类重组载体的药物组合物以及预防和治疗哺乳动物的骨关节炎的方法。具体地，本公开提供了腺相关病毒AAV载体，其能够在宿主中表达骨保护性软骨保护性生物活性蛋白，包括乙酰透明质酸合成酶2HAS2和润滑素PRG4。提供了产生这些AAV的方法，同样地提供了通过在滑膜和软骨细胞中长期基因表达骨保护性软骨保护性蛋白包括HAS2和PRG4来治疗哺乳动物关节中的骨关节炎的方法。

主权项：1.一种重组腺相关病毒在制备用于治疗患有骨关节炎的哺乳动物受试者的药物中的用途，其包括向所述哺乳动物受试者关节内施用治疗有效量的所述重组腺相关病毒，其中所述重组腺相关病毒包含与启动子可操作地连接的编码透明质酸合酶2多肽的核酸，其中所述透明质酸合酶2多肽在所述哺乳动物受试者中以有效减轻骨关节炎症状的量体内表达。

全文数据：用于治疗哺乳动物内骨关节炎和相关关节病症的表达骨保护性基因、包括HAS2和润滑素的重组AAV载体[0001]相关申请的交叉引用[0002]本申请要求2016年1月13日提交的美国临时专利申请号62278，243的优先权，所述临时专利申请通过引用整体并入本文。[0003]关于序列表的声明[0004]与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且通过引用并入本说明书。包含序列表的文本文件的名称是MER16-291SEQListing_ST25.txt。文本文件为57.6KB;其创建于2016年1月13日；并且与说明书的提交同时地将其通过EFS-Web以电子方式提交。发明领域[0005]本发明涉及重组载体、包含此类重组载体的药物组合物，以及在哺乳动物中预防和或治疗急性和或慢性关节病况包括骨关节炎）的方法。特别地，本发明涉及腺相关病毒AAV载体，其能够在宿主中表达属于透明质酸合酶2HAS2和润滑素PRG4蛋白家族的生物活性多肽。因此，本发明涉及基因工程领域，并提供基于腺相关病毒AAV的生物递送和表达系统，以用于通过在滑膜和软骨细胞中进行HAS2和LUB的长期基因表达来治疗人或哺乳动物关节中的骨关节炎。[0006]发明概述[0007]骨关节炎OA是一种在哺乳动物关节中发生并且构成严重的经济和医学问题的退行性关节病（Matthews,G.L.和Hunter,D.J.2011.ExpertOpin.EmergingDrugs1-13.;BrooksPM.CurrOpinRheumatol2002;14:573-577。软骨是一种坚韧的结缔组织，其在关节中覆盖骨的末端。其在坚硬的骨骼之间提供相对无摩擦的高度润滑的表面，并允许平稳运动。在OA发展期间，由于异常或过度磨损，软骨部分或完全丧失，这导致暴露的骨末端彼此摩擦，导致炎症、疼痛、肿胀或丧失活动性。目前，导致OA的初始软骨损失的详细原因尚不清楚，但发病率与年龄、肥胖和关节过度使用（诸如过度体育活动之间存在很强的相关性。[0008]在狗中，骨关节炎OA是跛足的最常见原因之一，并且据估计影响约20%的一岁以上的狗。目前没有治愈性治疗可用于0A，因此医学治疗一直以来主要针对缓解症状而不是重建软骨。镇痛治疗通常涉及类固醇和非类固醇抗炎药NSAIDS，其已在数十年中在OA的治疗方面显示出功效。然而，虽然这些药物可以抑制关节炎症，但已知它们中有许多对软骨具有恶化作用，这进一步恶化了OA发展的潜在过程。除了常规镇痛和抗炎疗法外，直接施用天然存在的骨保护性化合物已被用于缓解OA症状，取得了不同程度的成功。例如，透明质酸HA已被广泛用于恢复受累关节的粘弹性和润滑。此外，通过关节内或肌内途径注射的多硫酸化糖胺聚糖PSGAG以及口服施用的葡糖胺和硫酸软骨素已显示出一定的功效。[0009]然而，前述药物必须经常施用，有时甚至彼此组合施用，以实现有意义的症状缓解。这些频繁的关节注射是费力昂贵的，承受着感染的风险，并且对患者或动物造成很大的压力。虽然也开发了外科手术方法，但这些方法在狗和马中通常显示出低功效，从而通常仅在严重的晚期受试者中进行。[0010]除了递送补充剂药物以外，若干研究小组还已尝试通过递送粘弹性粘性保护性多肽、编码其的核酸或能够在宿主中表达的多肽或核酸、用于产生粘性保护性蛋白（例如，酶）的装置means来改善OA症状。更令人关注的方法包括使用润滑素多肽Flannery，US7,642,236B2、tribonectins属于RhodeIslandGeneralHospital的US7,618,914B2和透明质酸合酶（属于MillenniumPharmaceuticals的US6,423,514。[0011]这些努力中的一些可以被表征为“基因疗法”，其基本概念已被很好地建立EvansCH,RobbinsPD.Genetherapyforarthritis,In:ffolffJA编辑）.GeneTherapeutics:MethodsandApplicationsofDirectGeneTransfer·Birkhauser:Boston，1994，第320-343页）。最近，一个研究小组试图通过体内递送白细胞介素-I受体拮抗剂（Il-IRa基因来治疗骨关节炎（属于BaylorCollegeofMedicine的US20150031083A1;以及参见Frisbie,DD等，GeneTherapy2002〇[0012]Arthrogen公司已使用AAV5在类风湿性关节炎RA的情形中表达人干扰素β以减少炎性细胞因子）。与OA不同，炎症信号传导在RA的病理学中起重要作用，因此阻断该信号是关键的治疗方法。也就是说，寻求炎症与OA之间可能的联系的另一个研究小组在马OA的情形中使用重组AAV2来表达ILl受体诘抗剂^Goodrich等，BaylorCollegeofMedicine。[0013]然而，这些方法中没有一种已被证明是普遍有效的，并且对于缓解OA患者的疼痛和痛苦仍然存在显著的未满足的需求。由此可见，对更加有效和持久的，同时从长远来看同样具有成本效益的治疗存在明确且尚未满足的医疗需求。[0014]因此，如本文中详细描述的，本申请人首次成功证明重组腺相关病毒rAAV载体可通过单次关节内注射将编码治疗剂的cDNA递送至哺乳动物关节中，以促进在体内在滑膜细胞和软骨细胞中局部和连续地产生药剂。[0015]本申请人还首次分离了全长犬润滑素cDNASEQIDN0:4并对其进行了测序。[0016]本发明提供了在哺乳动物宿主中体内表达治疗有效量的骨保护性和或骨再生基因产物的rAAV载体。[0017]在一些方面，rAAV可含有编码具有疾病改善、润滑、抗炎和疼痛缓解特性的药剂的cDNA。[0018]在一些方面，rAAV载体是衍生自AAV血清型的载体，所述AAV血清型包括但不限于AAVI、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh·8和AAVrh.10。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含AAVI、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh·8或AAVrh.10的ITR。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含AAVI、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、△△¥7^六¥8^六¥9^六¥^1.8或六六¥^1.10的衣壳蛋白。在一些实施方案中，1了1?和衣壳衍生自同一AAV血清型。在其他实施方案中，ITR和衣壳衍生自不同的AAV血清型。在一些实施方案中，rAAV载体可以是AAV2或AAV5衣壳血清型。在一些相关的实施方案中，rAAV2和rAAV5载体含有至少一个衍生自AAV2的ITR。[0019]在一些实施方案中，rAAV载体编码透明质酸合酶-2HAS2或其变体。在一些实施方案中，HAS2是人HAS2。在其他实施方案中，HAS2是犬HAS2。在一些实施方案中，HAS2是密码子优化的HAS2。[0020]糖胺聚糖透明质酸HA是非硫酸化的糖胺聚糖，其由通过β-1-3和β-1-4糖苷键连接的重复的葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺残基组成。其提供多种生物功能，包括伤口愈合、细胞迀移、恶性转化和组织周转。HA由各种细胞类型包括内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞）合成，并且已经在组织诸如结缔组织、上皮组织和神经组织中被检测到。在关节空间中，HA由滑膜细胞其将HA分泌到滑液和软骨细胞产生。滑液HA为基质蛋白和生物力学提供润滑、组织水合、结构完整性和支架，以及在关节稳态中起作用。HA在关节中的生物学效应由其浓度和分子量决定。其的合成范围为50000至10,0000000。较低分子量的撤〈5001^参与受体介导的血管生成、恶性肿瘤和炎症的激活，而较高分子量的HA在关节中提供润滑。[0021]关节HA的大小和浓度受其合成和降解速率调节。HA的降解由透明质酸酶介导，所述透明质酸酶将HA切割成较小的片段，其排入淋巴系统以进行清除。已经描述了用于产生HA的三种酶，称为透明质酸合酶HAS1、2和3,其存在于滑膜细胞的质膜的内表面。其中，HAS2经显示负责高分子量HA的产生（Itano等，1999。据报道，在人患者和动物OA模型中，骨关节炎关节中的高分子量HA水平降低Plickert等，2013。这可能是由于HA的合成减少和透明质酸酶对HA的降解增加。在HA合酶中，HAS2和3在人软骨中表达，并且在这些HAS中，HAS2表达在人OA中减少。由于HA降解酶即透明质酸酶2的水平升高，HA水平也降低Yoshida等）。据报道，HAS2启动子响应于各种促炎和抗炎介质，这与报道的效应相互矛盾。这些介质包括TGFP、主要表皮生长因子（primaryepidermalgrowthfactor、TNFa和视黄酸（Guo,Kanter等，2007,Hyc等，2009。预期患病关节中通过炎症介质产生的下调会降低HAS2表达，从而导致HA水平降低，并且可以差异地影响各种HAS同种型David-Raoudi等，2009。相反，已报道了机械刺激Momberger等2005或软骨组分诸如硫酸软骨素刺激HA产生Momberger等，2005,David-Raoudi等，2009。说的产生导致细胞外周定位以及分泌到细胞外空间。目前尚不清楚什么调节分泌程度。然而，通常约80%的HA被分泌，而其余的则与产生性细胞保持缔合。这种细胞缔合的HA对基质蛋白的组装很重要；阻断HAS2合成将导致细胞缔合基质减少并且增加蛋白聚糖（即聚集蛋白聚糖至培养基中的释放，进一步证实了HAS2在软骨细胞中作为合成HA的主要酶的主要作用Nishida等，1999。[0022]在方面实施方案中，rAAV载体编码润滑素或其变体。在一些实施方案中，润滑素是人润滑素。在其他实施方案中，润滑素是犬润滑素。在一些实施方案中，润滑素是密码子优化的润滑素。[0023]润滑素Lubricin，PRG4，其是由关节滑膜衬里细胞和软骨的软骨细胞产生的大的粘蛋白糖蛋白，并为软骨表面提供保护性润滑Flannery1999，Schmidt2001,Waller2013。润滑素与HA—起也是滑液中的重要润滑剂，提供减震性能。在小鼠模型和罕见的人遗传疾病中缺乏润滑素导致骨关节炎OA特征性的软骨退化Rhee2005，Ruan2013。在人OA患者和各种动物OA模型中也证实了润滑素的合成减少Elsaid，2008。已显示利用重组润滑素的关节内润滑素补充可改善软骨病变Flannery2009。[0024]在一些实施方案中，rAAV载体可以是编码犬密码子优化的透明质酸合酶-2HAS2的AAV2或AAV5衣壳血清型。[0025]在一些方面，rAAV载体通过关节内递送施用。在一些实施方案中，rAAV通过单次关节内递送施用。在另一个实施方案中，在关节内施用后，来自rAAV转导的细胞的关联治疗剂cognatetherapeuticagent的体内产生和分泌可持续至少约6个月。[0026]在一些实施方案中，rAAV载体包含含有遍在启动子ubiquitouspromoter以及密码子优化的和物种匹配的转基因的表达盒参见例如图1A。[0027]在另一个方面，本公开提供了使用rAAV载体在动物的关节中体内表达骨保护性和或骨再生基因产物的方法。[0028]本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均通过引用整体并入。[0029]附图简述[0030]以举例的方式提供、但不旨在将本发明仅限于所述的特定实施例的以下详细描述，可以结合附图来最好地理解，其中：[0031]图IA是显示质粒上图）和rAAV病毒载体下图）中的HAS表达盒的图。[0032]图IB是显示用cHAS2表达质粒转染的细胞产生HA的图。将cHAS表达质粒转染到293细胞中，3天后收获条件培养基，并使用基于HA结合蛋白的检测系统定量培养基中的HA水平。缩写：CBAcHAS2，HAS2表达质粒。EGFP，EGFP表达质粒。未转染的阴性对照细胞。“Optimem”=在无血清培养基中生长的细胞。“完全”=在含血清培养基中生长的细胞。[0033]图IC是用于对来自cHAS转染的293细胞+或-透明质酸酶处理24小时）的条件培养基的组分进行分离的琼脂糖凝胶图像，证实了HA的表达。缩写:CM，条件培养基。MDa，分子量大小或标记。[0034]图2A是显示来自使用三重转染方法将cHAS2小规模包装到rAAV2和AAV5载体中的rAAV载体生产的图。将EGFP表达盒包装到AAV2中显示为阳性对照，将在衣壳质粒不存在的情况下cHAS的包装作为阴性对照。rAAV产量显示为每个细胞的DNA抗性颗粒DRP的量。[0035]图2B是显示来自通过三重转染进行的大规模载体生产的rAAV载体产量的图。显示了针对获得的多个载体批次获得的总滴度的实例。[0036]图2C是显示体外AAV2HAS2载体效力的图。通过各种MOI感染293细胞，并在3天后对条件培养基中的HA水平进行定量。[0037]图2D是显示AAV5HAS2载体在体外的效力的图。[0038]图3A是显示在正常犬关节中关节内注射rAAVHAS2载体后体重变化的图。[0039]图3B是显示软骨评分的图。[0040]图3C是显示滑膜评分的图。[0041]图4A是显示用于犬滑膜rAAV载体定量的样品收集位置的图。[0042]图4B是显示滑膜样品#3中载体基因组拷贝的定量的图。[0043]图4C是显示滑液样品#1中的载体基因组拷贝的图。AAV2和AAV5的载体剂量显示为L=低，M=中等，H=高如图3A-C所示）。在rAAV载体递送后28天收集所有组织样品，并通过qPCR针对BGHpA分析所述样品。[0044]图5A是显示在滑膜样品#3中载体衍生的cHAS表达的图。[0045]图5B是显示滑液样品#1中的载体mRNA的图。[0046]图5C是显示使用滑液样品#3分析的每只个体狗中的载体基因组和载体衍生的mRNA的图。AAV2和AAV5的载体剂量显示为L=低，M=中等，H=高。在rAAV载体递送后28天收集所有组织样品，并通过qPCR针对BGHpA分析所述样品。[0047]图6A是显示被收集来检测软骨中的rAAV载体和mRNA的股骨髁和胫骨坪样品的位置的图。[0048]图6B是显示使用股骨髁样品#1分析的每只个体狗中的载体基因组和载体衍生的mRNA的图。另外，显示了对侧未注射的右关节）的载体基因组拷贝（未被测试的样品#22除外）。[0049]图6C是显示每个组中载体基因组注射和未注射的关节）和mRNA拷贝的平均值的图。AAV2和AAV5的载体剂量显示为L=低，M=中等，H=高参见图3。在rAAV载体递送后28天收集所有组织样品，并通过qPCR针对BGHpA分析所述样品。[0050]图6D是显示每个组中胫骨坪软骨中的载体基因组PBS或载体注射的关节和mRNA拷贝的平均值的图。[0051]图7A是显示从左后膝关节收集的组织中每个处理组中的滑膜样品#3和#1和软骨股骨髁和胫骨坪）中的载体基因组的图。图7A和7B中显示的值表示组平均值±标准偏差〇1=5组。[0052]图7B是显示各种组织中来自rAAV5HAS2载体的载体基因组和mRNA的定量的图。[0053]图8A是显示犬滑液中的HA水平的图。定量在第7天基线）和第28天收集的SF样品中的HA水平。将每只动物中的HA水平针对基线水平进行标准化，表示为与载体施用前一周相比第28天的HA的百分比。[0054]图8B是显示在第-7天（基线）和第28天的犬滑液中HA水平的图。箭头指示与基线治疗前相比在第28天具有更高HA水平的动物。[0055]图9显示犬润滑素的完整氨基酸序列。加框区域指示外显子6粘蛋白结构域的位置。在缩短的犬润滑素下文中称为“cLubl”或“cLublco”）中缺失标以下划线的氨基酸378至782，并且KEPAPTT样重复潜在的0-连接的糖基化位点）的位置以粗体显示。当序列名称以“c〇”结尾时，其表示cDNA序列已被“密码子优化”。类似地，“nonco”表示未经密码子优化。[0056]图10是显示在实验中产生和使用的质粒的图。质粒含有缩短的（即工程化的内部缺失）、密码子优化的犬润滑素序列（cLublco、启动子minCBA或CBA和BGHpA位点。一些构建体含有N-或C-末端HiS-标签C-末端和从内含子序列中去除的ATG潜在起始密码子的修饰。前病毒AAV润滑素质粒在两个末端还含有侧翼ITR序列。[0057]图IlA是显示当将minCBAcLubl、CBACLUBl和CBHcLub-nonco构建体转染到293细胞中时产生的mRNA拷贝细胞的图。[0058]图IIB是显示当ΔATG6HisN’、6HisN’、6HisC’、WTcLub和EGFP构建体被转染至Ij293细胞中时产生的mRNA拷贝细胞的图。[0059]图12A是显示浓缩培养基上述质粒）中分泌的润滑素的水平的抗-润滑素Western印迹。使用犬滑液作为阳性对照。[0060]图12B是显示来自前病毒润滑素表达质粒的润滑素产生的Western印迹。分析两个克隆并将其与用minCBA-cLubco质粒获得的表达进行比较。将未转染的培养基和EGFP表达质粒转染的细胞作为阴性对照。[0061]图13A是显示编码犬润滑素的AAV2载体的小规模载体生产中的载体产量的图。分析两个cLub克隆-+6xHis-标签），并将其与EGFP和HAS2表达盒在前病毒含ITR质粒中的包装进行比较。阴性对照包括未转染的细胞和缺乏AAV2衣壳表达质粒的转染。[0062]图13B是显示编码犬润滑素的AAV5载体的小规模载体生产中的载体产量的图。将EGFP和cLub表达盒的前病毒质粒与表达AAV5衣壳的质粒一起转染。[0063]图14是显示rAAV5载体在体外的犬润滑素表达的抗-润滑素Western印迹。用不同量的rAAV5minCBA-cLubl感染人293细胞72小时，然后浓缩条件培养基。来自AAV5CBA-EGFP感染的细胞的培养基用作阴性对照。来自前病毒润滑素表达质粒转染的细胞的培养基用作阳性对照。[0064]图15是呈现SEQIDNO的概述的表。[0065]图16是犬与人润滑素的比对。[0066]图17是显示使用MMR模型的犬滑液中不同时间点的HA水平的图。在OA诱导前一周前）、诱导后两周和测试物品施用之前第〇天和测试物品递送后57天、112天和182天收集滑液。[0067]图18A是显示载体施用后182天来自犬OA关节的滑膜样品中的rAAV5载体的检测和表达的图。[0068]图18B是显示载体施用后182天犬OA关节的软骨股骨課）中的rAAV5载体的检测和表达的图。[0069]图18C概述了犬MMROA模型中第182天滑膜和软骨样品中的rAAV5载体基因组和cHAS2mRNA检测。[0070]图19显示作为实例的从一个经I3BS处理和两个经rAAV5cHAS2处理的犬关节的内侧获得的软骨表面的番红-〇染色切片。[0071]发明详述[0072]骨关节炎（OA是哺乳动物和狗中跛足的最常见原因之一，并且据估计影响大约20%的1岁的狗。OA是一种导致疼痛、炎症和关节活动性降低的进行性和退行性疾病。治疗OA需要改善关节润滑并且减少炎症和疼痛的新型安全有效的治疗方法。如本文所公开的，本申请人发现重组腺相关病毒rAAV载体可用于通过单次关节内注射递送编码治疗剂的基因，目的是在关节中提供局部和连续的药剂产生。用编码犬密码子优化的透明质酸HA合酶-2HAS2的AAV2和AAV5衣壳血清型产生rAAV载体。[0073]对AAV2和AAV5衣壳呈血清反应阴性的22只成年健康犬通过关节内注射接受rAAV21、5和IOxIO11Vg关节）、rAAV55xlOnVg关节或PBS对照）。在28天的研究后未观察到不良临床体征。组织病理学分析显示用rAAV5处理的关节中的滑膜炎症最轻，并且rAAV2治疗组没有显著变化。在所有rAAV处理的关节的滑膜中和大多数软骨样品中检测到载体基因组VG。与两种组织中的rAAV2相比，rAAV5载体导致更高的VG检测和mRNA表达。初步分析还显示HA水平在经治疗的关节的滑液中升高的趋势。总之，我们的研究在有限数量的狗中证明了，当通过单次关节内注射施用时，用编码HAS2的rAAV2和rAAV5载体将基因转移至犬关节组织并获得可接受的安全性特征。[0074]犬HA合酶2。在本发明的一个方面，本公开提供了包含AAV衣壳和单链DNA基因组的重组腺相关病毒rAAV载体。根据本公开的病毒衣壳可以使载体被摄取至关节细胞中，随后转运至细胞核中，导致治疗性基因的表达。在一些实施方案中，DNA基因组含有位于一个或多个表达盒的侧翼的一个或多个AAV反向末端重复序列（ITR，用于在动物宿主体内表达治疗性基因。在本发明的一些实施方案中，病毒基因不存在于rAAV基因组中或不从其表达。[0075]在本发明的一些实施方案中，一旦rAAV已被施用于动物并被动物细胞摄取，rAAV基因组将作为染色体外附加体持续存在。在一些实施方案中，本公开的rAAV可长期保持在关节细胞中；例如，但不限于超过约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年或3年。附加体型rAAV将继续表达，导致治疗剂的产生和分泌至滑液中，从而直接在关节中局部且连续地产生药剂。所选择的转基因产品可通过增加关节润滑、减少疼痛和软骨降解等来促进关节健康。[0076]在本发明的另一个方面，本公开提供了治疗有此需要的动物的方法，其包括向动物施用治疗有效量的根据本公开的rAAV的步骤。在一些实施方案中，该方法包括将所提出的产品直接施用于犬的受累关节中。在一些实施方案中，单次治疗足以影响动物病况的显著改善。[0077]在其他实施方案中，重复治疗。在一些实施方案中，在第一次施用后2-3周内重复治疗，在其他实施方案中，在第一次施用后超过3周给予第二次施用。在一些相关的实施方案中，第二剂量包括具有相同治疗性基因的rAAV的施用，并且rAAV包含与第一治疗相同的血清型衣壳，在其他相关实施方案中，第二剂量包括具有相同治疗性基因的rAAV的施用，但该rAAV包含与第一剂量不同的血清型衣壳。在一些实施方案中，rAAV具有血清型5衣壳。在需要重复施用的相关实施方案中，第一剂量可包括具有血清型5衣壳的rAAV的施用，并且第二剂量可包括具有血清型5衣壳的rAAV的施用。[0078]在一些方面，骨关节炎关节中HAS2蛋白的过表达升高了滑液中的HA水平，并通过增强HA的润滑、抗炎和疼痛缓解性质来改善关节健康。已显示HAS2的过表达导致由各种细胞类型体外在培养基中的HA水平升高。已使用CH0、293和COS细胞作为稳定转染子或瞬时转染证明了这一点。为了在体内在关节中提供HA的过表达，可通过使用编码HAS2表达盒的rAAV载体将HAS2cDNA递送至软骨和或滑膜HA合成的正常部位）。不希望受任何理论束缚，基因至细胞的转移将提供HAS2表达盒，用于持续表达HAS2和随后产生HA。由于治疗性载体将含有遍在启动子，因此与内源性HAS2启动子不同，其不会受到骨关节炎关节中存在的炎症介质的下调。当通过关节内注射施用载体时，其可导致各种细胞类型的转导，主要细胞类型是滑膜细胞。最后，已显示单独的HAS2蛋白足以合成HA，并且认为无其他相关蛋白或组分是体外产生HA所必需的Yoshida等）。[0079]犬润滑素。在一些方面，通过关节内递送编码润滑素的重组腺相关病毒rAAV载体作为犬骨关节炎OA的潜在治疗，增加了骨关节炎关节中的润滑素产量。润滑素是一种大的分泌糖蛋白，其可作为润滑剂起作用，保护关节内的软骨表面。本文所述的是全长犬润滑素的cDNA的发现和产生，所述cDNA用于设计犬润滑素（cLublco的缩短的且密码子优化的形式。然后将后者用于构建表达各种润滑素的质粒。在转染入HEK293细胞后，表征质粒的润滑素mRNA和蛋白质产生。数据显示每种构建体均产生润滑素mRNA和分泌的润滑素。用cLublco表达盒产生rAAV载体并证明了rAAVcLubl载体产生的可行性。用该构建体感染的HEK293细胞合成并分泌犬润滑素。[0080]本文所述的方法和组合物还可用于骨关节炎的治疗性治疗。术语“疗法”或“治疗性治疗”，当它们涉及骨关节炎，以及当它们在本文和兽医学领域中使用时，涉及已患有骨关节炎或正从骨关节炎恢复例如，处于恢复期）的受试者的治疗、或支持和或加速治疗，或旨在减缓和或逆转被诊断为患有骨关节炎或处于患骨关节炎的风险中的受试者的软骨损失的治疗。治疗的一个关键目标是降低向软骨和骨丢失的演变的风险。如本文中所用，如果合理地预期受试者患有与骨关节炎相关的进行性软骨丢失，则认为该受试者患有骨关节炎，或处于发生骨关节炎的风险中。特定受试者是否患有骨关节炎或处于发生骨关节炎的风险中可由相关兽医或医学领域中的普通技术人员来容易地确定。[0081]本文所述的方法和组合物还可用于骨关节炎的预防性治疗。术语“防治”、“预防”、“防治性治疗”和“预防性治疗”，当它们涉及骨关节炎，以及当它们在本文中以及人和兽医学领域中所使用时，涉及健康受试者或患有不相关疾病但被认为处于发生骨关节炎的风险中的受试者的治疗。[0082]本文描述了骨关节炎的疗法和预防性治疗其利用包含能够在体内表达HAS或润滑素多肽的载体的药物组合物和用于在关节中诱导透明质酸或润滑素浓度的持续增加以减少或消除软骨丢失的方法及组合物。[0083]如本文中所用，如果施用该量的组合物足以引起患有骨关节炎的哺乳动物受试者中该疾病的临床体征或可测量的标志物的显著改善，则所述药物组合物被认为具有“治疗功效”或是“治疗有效的”。如本文中所用，如果施用该量的组合物足以预防受试者中骨关节炎的发展，则所述药物组合物被认为具有“预防功效”或是“有效的”。[0084]本文还描述了能够在宿主中体内表达HAS或润滑素多肽或其变体或片段或组合的载体。在实施方案中，用于本发明的HAS或润滑素多肽与预期的目标物种在遗传上匹配例如，编码犬HAS2的载体被递送至患有OA的犬科动物）。[0085]通过举例说明的方式，本文所述的“变体”、“衍生物”等包括但不限于这样的HAS和润滑素变体、衍生物等，其由与本文公开的核苷酸序列不完全相同的核苷酸序列编码，但其中所述核苷酸序列中的变化不改变编码的氨基酸序列，或导致氨基酸残基的保守取代、一个或几个氨基酸的缺失或添加、不显著影响编码的多肽的性质例如，变体或衍生物具有超过约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的野生型多肽的所需活性的氨基酸类似物对氨基酸的取代等。保守氨基酸取代的实例包括甘氨酸丙氨酸取代;缬氨酸异亮氨酸亮氨酸取代;天冬酰胺谷氨酰胺取代;天冬氨酸谷氨酸取代；丝氨酸苏氨酸蛋氨酸取代;赖氨酸精氨酸取代;和苯丙氨酸酪氨酸色氨酸取代。本文还描述了导致功能性HAS或润滑素衍生物的其他类型的取代、变化、添加、缺失和衍生物，并且本领域技术人员将容易知道如何制备、鉴定或选择此类变体或衍生物，和如何测试那些变体或衍生物的HAS或润滑系活性。本领域技术人员可优化本发明的HAS或润滑素多肽的表达;例如，但不限于去除隐蔽的剪接位点，通过在起始密码子之前引入Kozak共有序列来调整密码子用法，改变密码子用法或其组合以改善表达。[0086]用于本发明的载体可包含编码包含SEQIDN0:2所示的氨基酸序列的犬HAS2多肽的核酸序列。在一些实施方案中，犬HAS2多肽是与SEQIDN0:2具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性或或同一性的犬HAS2变体。[0087]用于本发明的载体可包含编码包含SEQIDN0:7所示的氨基酸序列的犬润滑素多肽的核酸序列。在一些实施方案中，所述犬润滑素多肽是与SEQIDNO:7具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性或同一性的犬润滑素变体。[0088]序列同一"性或同源性可通过在对齐以最大化重叠和同一"性、同时使序列缺口最小化时比较序列来确定。具体地，可使用许多数学算法中的任何一种来确定序列同一性。用于比较两个序列的数学算法的一个非限制性实例是KarIiηAItSChuI，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1990,87,2264-2268的算法（如在KarIinAltschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1993,90,5873-5877中改进的）。[0089]用于比较序列的数学算法的另一个例子是MyersMiller，CABI0S1988,4,11-17的算法。这种算法被并入ALIGN程序2.0版），该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分为12、缺口罚分为4〇用于鉴定局部序列相似性和比对的区域的另一种有用的算法是如PearsonLipman，Proc·Natl·Acad·Sci·USA1988，85，2444-2448中描述的FASTA算法。[0090]通常，氨基酸序列的比较可通过将具有已知结构的多肽的氨基酸序列与具有未知结构的多肽的氨基酸序列进行比对来实现。然后比较序列中的氨基酸，并将同源的氨基酸的组组合在一起。该方法检测多肽的保守区域并解释氨基酸插入和缺失。氨基酸序列之间的同源性可通过使用商购可得的算法来确定也参见上文中同源性的描述）。除了本文另外提及的那些以外，还提及由国家生物技术信息中心提供的程序BLAST、gappedBLAST、BLASTN、BLASTP和PSI-BLAST。这些程序在本领域中被广泛地用于该目的，并且可以比对两个氨基酸序列的同源区域。[0091]在套件中的所有搜索程序中，缺口比对程序对于数据库搜索本身是内在的。如果需要，可以关闭缺口。对于蛋白质，BLASTP中长度为1的缺口的默认罚分Q是Q=9，BLASTN中Q=10，但其可被改变为任何整数。对于蛋白质，BLASTP中延伸缺口的默认每残基罚分R为R=2,对于BLASTN为R=10,但其可被改变为任何整数。可使用Q和R的值的任何组合以对齐序列，以最大化重叠和同一性，同时使序列缺口最小化。默认氨基酸比较矩阵是BL0SUM62，但也可使用其他氨基酸比较矩阵诸如PAM。[0092]术语“蛋白质”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用，是指具有任何长度的氨基酸残基的聚合物。[0093]如本文中所用，术语“多核苷酸”用于指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，其含有脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。[0094]如本文中所用，术语“载体”是指重组DNA或RNA质粒或病毒，其包含待被诸如体内递送至靶细胞的异源多核苷酸。异源多核苷酸可包含用于治疗目的的目标序列，并且可以任选地以表达盒的形式存在。如本文中所用，“载体”不需要能够在最终靶细胞或受试者中复制。[0095]如本文中所用，术语“重组”意指半合成的或合成来源的多核苷酸，其在自然界中不存在或以在自然界中不存在的排列与另一多核苷酸连接。[0096]如本文中所用，术语“异源的”意指来源于与同其比较的实体的其余部分在遗传上不同的实体。例如，可通过遗传工程技术将多核苷酸置于来源于不同来源的质粒或载体中，因此是异源多核苷酸。因此，从其天然编码序列中除去并且与除天然序列外的编码序列可操作地连接的启动子是异源启动子。[0097]根据本发明使用的多核苷酸可以包含额外的序列，诸如同一转录单元内的其他编码序列、控制元件诸如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、多聚腺苷酸化位点、在相同或不同启动子控制下的其他转录单位、允许克隆、表达、同源重组和宿主细胞转化的序列，以及可能被需要来提供本发明实施方案的任何此类构建体。[0098]在一个方面，本公开提供了治疗患有骨关节炎OA或处于发生骨关节炎的风险中的哺乳动物受试者的方法，其包括向所述哺乳动物受试者施用治疗有效量的腺相关病毒AAV，所述腺相关病毒含有编码骨保护性或骨再生性多肽并与启动子可操作地连接的核酸序列，其中所述多肽在哺乳动物受试者中体内表达，并且以有效减轻或预防OA症状的量表达。在一些实施方案中，施用是通过关节内途径。[0099]在一些实施方案中，所述多肽可编码透明质酸合酶HAS，包括HAS2HAS2、润滑素、白细胞介素-1受体IL-IR拮抗剂、胰岛素样生长因子IIGF-I、成纤维细胞生长因子2FGF-2、转化生长因子βΐTGFm、骨形态发生蛋白7BMP7、葡萄糖胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶GFAT、白细胞介素10IL-10、血红素加氧酶-1H0-1、其生物活性截短或其组合。在一个实施方案中，哺乳动物受试者可以是人、犬科动物或猫科动物。在一个具体实施方案中，受试者是犬科动物。[0100]在一些实施方案中，哺乳动物受试者患有慢性骨关节炎或处于发展慢性骨关节炎的风险中。[0101]在其他实施方案中，多肽是犬HAS2或犬润滑素。在一些实施方案中，编码HAS2多肽的核酸序列具有与SEQIDN0:3中所示的序列具有至少90%同一性的序列，或编码润滑素多肽的核酸序列具有与SEQIDN0:6中所示的序列具有90%同一性的序列。[0102]在一些实施方案中，HAS2多肽包含SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，HAS2多肽具有选自与SEQIDNO:2中所示的序列具有至少90%同一性的多肽的氨基酸序列、在受试者中体内各自表现出HAS活性的其片段、变体和同系物。“HAS活性”意指生物活性透明质酸的产生。[0103]在一些实施方案中，AAV载体从5’至3’包含以下元件：5’AAVITR、填充片段、CBA、内含子IN、cHAS2密码子优化的cDNA、多聚腺苷酸化信号pA和3’AAVITR。[0104]在一些实施方案中，润滑素多肽包含SEQIDN0:7中所示的氨基酸序列。在其他实施方案中，润滑素多肽具有选自与SEQIDN0:7中所示的序列具有至少90%同一性的多肽的氨基酸序列、在受试者中在体内各自表现出润滑素活性的其片段、变体和同系物。“润滑素活性”意指以与内源生产的润滑素基本相同的方式和基本上相同的程度提供润滑。这种润滑活性可以根据本领域已知的技术（参见，例如Swan，DA等BiochemJ.1985Jan1;225I:195-201来测量。[0105]在一些实施方案中，启动子可以选自CMVIE启动子、RSV启动子、HSV-ITK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α_1抗膜蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、CBA启动子、β-肌动蛋白基因启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶CK基因启动子。[0106]在其他实施方案中，AAV包含AAV2或AAV5衣壳。[0107]在另一个方面，本公开提供了增加哺乳动物例如，人或犬科动物的软骨细胞和或滑膜细胞中的透明质酸产生的方法。在一个实施方案中，该方法可包括以下步骤:向哺乳动物例如，人或犬科动物施用包含rAAV载体基因组的重组AAV“rAAV”），其中所述rAAV载体基因组包含编码HAS2的核酸，使HAS酶表达足够的时间，随后催化另外的透明质酸产生，从而升高哺乳动物中的透明质酸水平。[0108]本公开还提供了增加哺乳动物例如，人或犬科动物）的软骨细胞和或滑膜细胞中的润滑素多肽产生的方法。在一个实施方案中，该方法可包括以下步骤：向哺乳动物例如，人或犬科动物施用包含rAAV载体基因组的rAAV，其中所述rAAV载体基因组包含编码润滑素的核酸，使润滑素表达足够的时间，从而升高犬科动物中的润滑素水平。[0109]在一个实施方案中，在施用包含编码HAS2的核酸的rAAV后，HAS2以足以治疗或预防哺乳动物例如，人或犬的OA症状的量产生。[0110]在另一个实施方案中，在施用包含编码润滑素的核酸的rAAV后，润滑素以足以治疗或预防哺乳动物例如，人或犬的OA症状的量产生。[0111]在一个实施方案中，将HA水平恢复至健康哺乳动物例如，人或犬）中存在的水平。本领域技术人员可参考各种参考文献以了解在健康动物中存在何种水平的HA例如，Smith,GN等ArthritisRheum.1998;41:976_985;BalazsE等DisordersoftheKnee.Philadelphia:JBLippincott;1982.第61-74页）〇[0112]在另一个实施方案中，将润滑素水平恢复至在健康哺乳动物例如，人或犬）中存在的水平。[0113]另一方面，本发明提供治疗患有OA或处于发生OA的风险中的犬的方法，其包括向所述犬施用治疗有效量的AAV载体，所述AAV载体含有与启动子可操作地连接的编码HAS2或润滑素多肽的核酸序列。在另一个实施方案中，本公开提供了治疗患有OA或处于发生OA风险中的人的方法，其包括向所述人施用治疗有效量的AAV载体，所述AAV载体含有与启动子可操作地连接的编码HAS2或润滑素多肽的核酸序列。[0114]在一些实施方案中，编码HAS2多肽的核酸序列与SEQIDN0:3中所示的核酸序列具有至少90%同一性，或编码润滑素多肽的核酸序列与SEQIDN0:6所示的核酸序列具有至少90%同一*性。[0115]在一些实施方案中，AAV编码包含SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的HAS2多肽，或包含与SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列具有至少90%同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV编码包含SEQIDN0:7中所示的氨基酸序列的润滑素多肽，或包含与SEQIDN0:7中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。[0116]在任何实施方案中，启动子可选自CMVIE启动子、RSV启动子、HSV-ITK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α_1抗膜蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、β-肌动蛋白基因启动子、CBA启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶CK基因启动子。[0117]另一方面，本发明提供了预防处于发生OA的风险中的哺乳动物受试者中OA发生的方法，其包括向所述犬施用预防有效量的包含AAV载体基因组的rAAV，所述AAV载体基因组包含与启动子可操作地连接的编码HAS2或润滑素多肽的核酸序列。在一个实施方案中，编码HAS2多肽的核酸序列与SEQIDNO:3中所示的核酸序列具有至少90%同一性，或编码润滑素多肽的核酸序列与SEQIDN0:6中所示的核苷酸序列具有至少90%同一性。在另一个实施方案中，核酸编码包含SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列的HAS2多肽，或核酸编码包含SEQIDN0:7中所示的氨基酸序列的润滑素多肽。在一个实施方案中，启动子可以选自CMVIE启动子、RSV启动子、HSV-ITK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α-l抗胰蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、肌动蛋白基因启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶基因启动子。在一些实施方案中，rAAV载体包含CBA-CHAS2C0-BGH。在其他实施方案中，rAAV载体包含pITRminCBA-HIb-cLublco-BGH。[0118]另一方面，本发明提供了重组质粒载体，其包含与启动子可操作地连接的编码犬HAS2或润滑素多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码HAS2多肽的核酸序列与SEQIDNO:3中所示的核酸序列具有至少90%同一性，或编码润滑素多肽的核酸序列与SEQIDNO:6中所示的核酸序列核酸具有至少90%同一性。在一些实施方案中，核酸编码包含SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列的HAS2多肽，或核酸编码包含SEQIDN0:7中所示的氨基酸序列的润滑素多肽。[0119]在一个方面，本公开提供了药物组合物，其包含编码HAS或润滑素并在哺乳动物宿主中体内表达其的重组病毒载体和任选地一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。[0120]在另一个方面，本公开提供了治疗患有骨关节炎或处于发生骨关节炎的风险中的哺乳动物受试者的方法，其包括向所述哺乳动物受试者关节内地施用治疗有效量的上述药物组合物。在一个实施方案中，受试者是人或犬。[0121]在另一个方面，本公开提供了基于腺相关病毒AAV的生物递送和表达系统，以用于治疗或预防人或哺乳动物关节中的0A。在一些实施方案中，该方法通过在递送rAAV后在滑膜和或软骨细胞中长期基因表达人或哺乳动物HAS2或润滑素来实现，所述rAAV包含编码人或哺乳动物HAS2或润滑素的核酸序列、左和右AAV反向末端重复序列LITR和RITR、AAV包装信号和任选地非病毒非编码填充核酸序列。在一些实施方案中，人或哺乳动物HAS2或润滑素基因在滑膜和或软骨细胞内的表达受炎症诱导型启动子调节，该启动子位于编码人或哺乳动物HAS2或润滑素的核酸序列的阅读框架的上游，并且被升高的水平的免疫刺激物质特异性激活。[0122]在一些实施方案中，炎症诱导型启动子选自以下启动子:NF-kB启动子、白细胞介素6II-6启动子、白细胞介素-III-I启动子、肿瘤坏死因子TNF启动子、环加氧酶2C0X-2启动子、补体因子3C3启动子、血清淀粉样蛋白A3SAA3启动子、巨噬细胞炎性蛋白-laMIP-Ia启动子及其杂合构建体。在一些实施方案中，rAAV载体基因组包含SEQIDN0:3、SEQIDN0:6中所示的核酸序列，或其生物学有效变体。在一些实施方案中，AAV系统包含编码允许监测滑膜和软骨细胞中的载体基因组的标记基因的核酸。在一些实施方案中，载体包含SEQIDN0:3、SEQIDN0:6中所示的核酸序列或其编码相同氨基酸的保守序列。在一些实施方案中，rAAV载体基因组包含编码SEQIDN0:2中所示的HAS2多肽或SEQIDN0:7中所示的润滑素多肽的核酸。rAAV载体基因组可包含与SEQIDN0:3中所示的核酸序列具有至少80%或90%序列同一性的核酸分子。在其他实施方案中，rAAV载体基因组包含与SEQIDN0:6中所示的核酸序列具有至少80%或90%序列同一性的核酸分子。[0123]在AAV系统的一些实施方案中，该系统包含编码人或哺乳动物HAS2或润滑素的核酸序列、左和右AAV反向末端重复序列LITR和RITR、包装信号和任选地非病毒非编码填充核酸序列，以用于治疗或预防骨关节炎OA，其中所述人或哺乳动物HAS2或润滑素基因在滑膜和或软骨细胞内的表达受炎症诱导型启动子调节，该启动子被升高的水平的免疫刺激物质特异性激活。[0124]病毒颗粒和产生病毒颗粒的方法[0125]本文还提供了包含编码HAS2或润滑素的核酸的病毒颗粒。病毒载体可用于递送编码HAS2或润滑素的核酸，以用于在特定位置例如，关节）内的靶细胞中表达所述蛋白质。已知许多种病毒，并且出于将核酸递送至靶细胞中的目的已经研究了许多病毒。可将外源核酸插入载体，诸如腺相关病毒AAV。[0126]在一些实施方案中，病毒颗粒是包含核酸的重组AAV颗粒，所述核酸含有一个或两个AAVITR和侧翼连接有一个或两个ITR的编码本文所述的HAS2或润滑素的序列。核酸被包封在AAV颗粒中。AAV颗粒还包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，核酸以转录方向包含可操作地连接的组分，包括转录起始和终止序列的调控序列，和目标蛋白质编码序列（例如，编码融合蛋白的核酸）。这些组分在5’和3’末端上侧翼连接有功能性AAVITR序列。“功能性AAVITR序列”意指ITR序列如所预期的用于拯救、复制和包装AAV病毒体。参见Davidson等，PNAS，2000，9773428-32;Passini等，J·Virol·，2003，7712:7034-40;和Pechan等，GeneTher.,2009,16:10-16,所有这些文献都通过引用整体并入本文。为了实施本发明的某些方面，重组载体包含至少所有对衣壳化是必需的AAV序列和rAAV感染所需的物理结构。用于本发明的载体的AAVITR不必具有野生型核苷酸序列（例如，如Kotin,Hum.GeneTher.，1994，5:793-801中所述的），并且可通过核苷酸的插入、缺失或取代改变，或者AAVITR可源自几种AAV血清型中的任何一种。目前已知超过40种AAV血清型，并且新的血清型和现有血清型的变体不断地被鉴定。参见Gao等，PNAS，2002，9918:11854-6;Gao等，PNAS，2003,10010:6081-6;和Bossis等，J.Virol.,2003,7712:6799-810。任何AAV血清型的使用都被认为在本发明的范围内。在一些实施方案中，rAAV载体是源自AAV血清型的载体，所述AAV血清型包括但不限于AAVI、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh·8和AAVrh.10。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含AAVl、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8或AAVrh.10的ITR。在其他实施方案中，rAAV颗粒包含AAVl、AAV2、[0127]不同的AAV血清型用于优化特定革El细胞的转导或祀向特定革[1例如，关节）内的特定细胞类型。rAAV颗粒可包含相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。例如，rAAV颗粒可包含AAV2衣壳蛋白和至少一种AAV2ITR，或其可包含AAV2衣壳蛋白和至少一个AAV5ITR。在另一个实例中，rAAV颗粒可包含AAV5衣壳蛋白和至少一个AAV2ITR。本文提供了用于产生rAAV颗粒的AAV血清型的任何组合，就如同每种组合已在本文中被明确地说明。[0128]可以使用本领域已知的方法生产rAAV颗粒。参见，例如，美国专利第6，566，118号、第6，989，264号、第6，995，006号。在实施本发明时，用于产生rAAV颗粒的宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、微生物和酵母。宿主细胞也可以是其中AAVrep和cap基因稳定地维持在宿主细胞中的包装细胞或其中AAV载体基因组得以稳定地维持的生产细胞中。示例性包装和生产细胞源自293、A549或HeLa细胞。使用本领域已知的标准技术纯化和配制AAV载体。[0129]在一些方面，提供了用于产生本文公开的任何rAAV颗粒的方法，其包括a在产生rAAV颗粒的条件下培养宿主细胞，其中宿主细胞包含⑴一种或多种AAV包装基因，其中每个所述AAV包装基因编码AAV复制或衣壳化蛋白；（iirAAV原-载体，其包含侧翼连接有至少一个AAVITR的编码本文公开的任何融合蛋白的核酸，和（iiiAAV辅助功能;和⑹回收宿主细胞产生的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述至少一个AAVITR选自AAV1，AAV2，AAV3，△△¥4，厶厶¥5，厶厶6，厶厶¥7，厶厶¥8，厶厶¥9，厶厶¥^1.8和厶厶¥^1.10叮1?。在一些实施方案中，所述衣壳化蛋白选自AAVl，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AA6，AAV7，AAV8，AAV9，AAVrh·8和AAVrh·IO衣壳蛋白。在进一步的实施方案中，纯化rAAV颗粒。如本文中所用，术语“纯化的”包括不含至少一些也可存在的另外组分rAAV天然存在于其中或最初从其中制备）的rAAV颗粒的制剂。因此，例如，可使用从来源混合物诸如培养物裂解物或生产培养上清液）中富集其的纯化技术制备分离的rAAV颗粒。富集可以以多种方式测量，诸如，例如通过溶液中存在的DNA酶抗性颗粒DRP的比例，或通过感染性，或者可以相对于存在于来源混合物中的第二潜在干扰物质诸如污染物包括生产培养污染物或过程中的污染物，包括辅助病毒、培养基组分等）测量其。[0130]本文还提供了包含rAAV颗粒的药物组合物，所述rAAV颗粒包含编码本发明的HAS2或润滑素的核酸和药学上可接受的载体。药物组合物可适用于本文所述的各种施用方式，包括例如全身性施用或局部施用。可以例如通过静脉内注射，通过导管参见美国专利第5，328，470号）或通过立体定位注射Chen等，1994，PNAS，91:3054-3057全身性引入包含编码本文所述的HAS2或润滑素的核酸的rAAV的药物组合物。在一些实施方案中，包含本文所述的rAAV和药学上可接受的载体的药物组合物适于施用于人。此类药学上可接受的载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油等。盐水溶液和葡萄糖水溶液、聚乙二醇PEG和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。药物组合物还可包含另外的成分，例如防腐剂、缓冲剂、张力剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子型润湿剂或澄清剂、增粘剂等。可以以单一单位剂量或多剂量形式包装本文所述的药物组合物。通常将组合物配制成无菌和基本上等渗的溶液。[0131]参考文献[0132]本文中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本文中，用于所有目的：[0175]YoshidaMetal.Expressionanalysisofthreeisoformsofhyaluronansynthaseandhyaluronidaseinthesynoviumofkneesinosteoarthritisandrheumatoidarthritisbyquantitativereal-timereversetranscriptasepolymerasechainreaction.ArthritisResearchTherapy2004,6:R514-R520..实施例[0176]实施例IHAS2AAV载体构建体和评估[0177]实施例Ia概述[0178]产生含有密码子优化的犬HAS2cDNA和遍在启动子的rAAV载体并将其包装到AAV2或AAV5衣壳中。通过三重转染法产生大规模载体批次，并通过CsCl梯度进行纯化。通过qPCR针对牛生长激素BGHpolyA位点pA定量载体产量。对于AAV2HAS2,总共产生4个批次其中3个批次合并用于体内研究，2xl013DRP总计）。对于AAV5HAS25xl012DRP总）产生两个批次来测试产量的一致性并获得足够量的病毒。[0179]对AAV2和AAV5衣壳呈血清反应阴性的22只成年健康犬通过关节内注射接受rAAV21、5和IOxIO11Vg关节）、rAAV55xlOnVg关节或PBS对照）。在28天的研究后未观察到不良临床体征。组织病理学分析显示用rAAV5处理的关节中的滑膜炎症最轻，并且rAAV2治疗组没有显著变化。在所有rAAV处理的关节的滑膜中和大多数软骨样品中检测到载体基因组VG。在两种组织中与rAAV2相比，rAAV5载体导致更高的VG检测和mRNA表达。注意到经处理的关节的滑液中HA水平升高的趋势。总之，所公开的结果证明了编码HAS2的rAAV2和rAAV5载体当通过单次关节内注射向犬施用时将基因转移至犬关节组织并且获得可接受的安全特征。[0180]实施例Ib-方法[0181]HA表达载体的克隆和产生。通过GeneArtInvitrogen的算法对犬HAS2基因GenBankXM539153.3;SEQIDNO:1进行密码子优化以在犬中表达。合成侧翼连接有NheI-NsiI限制性内切酶位点的密码子优化的犬HAS2cDNA1656bp;SEQIDN0:3。然后将该片段克隆到含有遍在鸡b-肌动蛋白启动子CBA、杂合内含子和牛生长激素BGHpolyApA的质粒中。使用maxi试剂盒Qiagen纯化所得的pCBA-HI-cHAS2-BGHpA质粒以用于表达分析。[0182]cHAS2的体外表达和HA的产生。将含有cHAS2的质粒载体转染到293细胞中，3天后将条件培养基和细胞裂解物收集到250μ1RIPA缓冲液加蛋白酶抑制剂中。旋转细胞裂解物以除去细胞碎片，并将30μ1细胞裂解物加载到4-12%nu-page凝胶上，并在lxMops缓冲液中运行。将蛋白质凝胶转移到硝酸纤维素膜上，并在4°C下用抗-HAS2sc-34-068;SantaCruzBiotechnology在PBS-T0·l%tween_20中的5%牛奶中进行探测。使用驴抗-山羊二抗以1:5000稀释度作为二抗。β肌动蛋白检测用于显示细胞裂解物的相等加载。[0183]体外培养物中HA水平和分子量的定量。通过将pCBA-HI-cHAS2-BGHpA转染到293细胞（在Optimem或完全培养基中）来评估表达HAS2的细胞的HA产量。使用HA测试试剂盒Corgenix，Inc.定量条件培养基的HA水平。该试剂盒含有源自聚集蛋白聚糖的HA结合蛋白。通过在琼脂糖凝胶上运行浓缩的条件培养基来评估HA的分子量。并行运行各种HA分子量标记物（Select-HAHiLadder，Hyalose，Austin，TX。并行运行类似的凝胶，然后消化透明质酸酶，持续24小时。两种凝胶均用Al1-stain染色。[0184]具有cHAS的rAAV载体的产生。将cHAS2表达盒克隆到含有AAVITR的质粒中，以产生侧翼连接有AAV反向末端重复序列（前病毒质粒pDC627的表达盒，以构建psITRCBA-HI-cHAS2-BGHpA。将600bp的填充DNA染色体16P1克隆96.4B包含在表达盒的上游，以产生总共4500bp的病毒载体基因组。为了测试含有cHAS2表达盒的质粒的包装，将293个细胞以8xl05个细胞孔6孔板接种，第二天用psITRCBA-HI-cHAS2-BGHpA或psp70EGFP、pHLP-19cap2或p5repCMVcap5质粒和pAdHELP以一式两份进行转染PromegaCaP04试剂盒）。3天后收集细胞，使用qPCR分析和针对BGHpA序列的引物探针（SEQIDNO:12-14滴定裂解物的BGHpA拷贝。含有BGHpA的质粒用作标准。rAAV病毒产量表示为每个细胞的DNA酶抗性颗粒DRP的量。使用psitRCBA-HI-cHAS2-BGH、pIM45BDrep-cap质粒（对于AAV2载体）和pHLP19-cap5对于AAV5载体和pAdHELP的三重转染进行大规模载体生产。通过CsCl纯化载体，并使用TaqMan分析和针对BGHpA序列的引物探针（AppliedBiosystemsLifeTechnologies滴定所得的载体批次。[0185]rAAVcHAS2在体外在兔软骨细胞和滑膜细胞中的功效。使用兔细胞测试载体转导关节细胞类型诸如初级滑膜细胞和软骨细胞的能力。用le5DRP细胞感染细胞并将所述细胞培养3天。收集细胞裂解物以通过Western印迹检测HAS2蛋白，并如上所述定量培养基的HA水平。为了测试HA产生对疾病状态下的基质降解蛋白酶、炎性细胞因子和软骨结构蛋白产生的影响，首先用rAAV载体感染细胞，然后在24小时后用IL-Ib进行刺激。24小时后，收集细胞和培养基以用于mRNA分析和HA产生。[0186]正常犬关节中的rAAVcHAS2评估。使用混合品种的狗雄性和雌性，8-lOkg。将针对AAV2和或AAV5衣壳的血清滴度〈4或为4的犬用于该研究。通过关节内途径施用编码：骱52的^八¥2和厶厶¥5载体0厶¥2:1、5和1^1〇11、厶厶¥5,511〇11〇1^关节）。？85用作阴性对照。注射前每天一次持续7天）、注射后每天两次持续7天）以及随后在研究期间每天一次观察动物的临床症状疼痛、跛行、注射关节的肿胀和其他异常）。4周后处死动物。在施用后-7天、1天、14天和28天收集全血样品用于白细胞WBC计数。在第-7天、第14天和第28天收集滑液（SF样品用于定量HA水平。收集滑膜组织、软骨和肝脏样品用于DNA和RNA分离。使用BGHpA引物探针组AppliedBiosystemsLifeTechnologies通过qPCR分析测定cHAS2载体基因组和mRNA拷贝。对于组织学分析，将膝盖的内侧胫骨、股骨、滑膜包埋在石蜡中并切片。切片用甲苯胺蓝染色，并由委员会认证的兽医病理学家进行检查。评估软骨的软骨损伤严重度和蛋白聚糖损失评分:0-5。针对炎症细胞的密度对滑膜病理学进行评分评分：0-5，因为未观察到滑膜增厚。[0187]实施例Ic-结果[0188]HAS2表达盒的密码子优化和产生。哺乳动物HAS2是一种高度保守的蛋白质。例如，HAS2的人和犬氨基酸序列仅含有2个氨基酸差异99.3%同一性）。类似地，犬与兔HAS2之间仅有3个氨基酸不同（99.5%。在DNA水平上，犬与人HAS2合酶cDNA之间的相似性为93.9%。由于密码子优化可改善基因表达，因此由GeneArtInvitrogen优化犬HAS2GenBank序列XM539153.3。这导致与原始GenBank序列具有78%相似性的核苷酸序列。优化的cDNA的GC含量从44.4%增加至59.0%。该cDNA用于产生具有CBA启动子的遍在表达质粒，以允许HAS2的组成型表达，与内源启动子不同（图1AXBA启动子受各种促炎和抗炎细胞因子的影响更小。[0189]体外HAS2表达和HA产生。为了在体外测试HAS2蛋白的表达，用CBA-HI-cHAS2-BGHpA质粒载体的两个克隆#1和2转染293细胞，然后通过Western印迹分析细胞裂解物的HAS2蛋白（膜蛋白）。用该表达质粒转染的细胞显示出处于64kDa的条带，其是cHAS的预期大小（未显示）。我们接下来评估了293细胞中HAS2蛋白的过表达是否导致培养基中HA的检测增加，所述增加的检测表明HA的产生和跨细胞膜的分泌。与未转染的细胞和CBA-EGFP转染的细胞相比，来自用pCBA-cHAS2转染的细胞的培养基中的HA水平分别增加了6.5倍和9倍图1B。因此数据证实了cHAS2在细胞中的过表达导致细胞外区室中的HA水平升高。在琼脂糖凝胶上评估体外产生的HA的大小。数据显示从用HAS2表达盒转染的细胞获得的条件培养基中的高分子量HA。该材料的尺寸大于1.5兆道尔顿MDa基于利用HA分子量标记物的估计）。在用透明质酸酶消化后，该物质消失，表明材料为HA图1C。[0190]具有HAS2表达盒的rAAV载体的产生。随后将cHAS2co表达盒克隆到具有AAVITR的质粒中。所得病毒基因组的示意图显示于图IA中。在小规模包装实验中测试了用AAV2和AAV5衣壳和HAS2cDNA产生rAAV载体的能力（图2A，随后进行更大规模的载体产生。可以使用标准三重转染方法产生AAV2和AAV5载体（图2B。通过感染293细胞并分析培养基中HA水平的产生来测试该材料的效力。AAV2和AAV5载体均导致培养基中HA的剂量反应性增加（图2C，D〇[0191]正常犬关节中rAAVHAS2载体评估。通过关节内施用将具有cHAS2的rAAV2和AAV5载体递送到正常狗的关节中，并评估动物28天。在研究期间未观察到不利的临床体征、体重变化（图3A、跛行或死亡。一些动物在第-7天具有升高的白细胞WBC计数，这可能是由于运输应激造成的。一般而言，第1天、第14天和第28天的WBC计数在正常限度范围内。来自注射PBS、AAV的（左和对侧的未注射的）的膝盖的组织学评价显示出非常少的蛋白聚糖损失和软骨退化评分范围〇-〇.5;最大分值5图3B。这些微小的变化是典型的与年龄相关的自发变化。对于I3BS-和AAV2-处理的关节和对侧关节观察到轻微的滑膜变化（图3C。在用AAV5载体处理的雄性和雌性的所有左膝中均观察到最小限度至轻度滑膜炎通常延伸至关节囊和内侧副韧带）（在对侧关节中未观察到滑膜炎）。因此，整体上治疗耐受良好，几乎未观察到不利影响。[0192]分析从滑膜和软骨收集的组织样品以检测病毒基因组（图4A、6A。最接近注射部位收集的滑液样品，样品#3,显示在所有AAV处理的关节中存在载体基因组（图4BKAAV2处理的关节含有大约0.01至2个载体基因组VG细胞。有趣的是，尽管低剂量组与高剂量组之间存在10倍的差异，但对于AAV2观察到的剂量反应轻微。用AAV5载体处理的关节显示更高和更一致的检测，范围为1至12个拷贝细胞。在一些对侧未注射的关节中，检测到低水平的VG，其在低AAV2处理组中更明显，在较高AAV2剂量和AAV5组中更加零星发生未显示）。[0193]分析从注射部位进一步收集的滑膜样品（样品#1以评估关节中的AAV扩散（图4C。用AAV2低剂量注射的关节显示出更一致的VG检测。这些水平与滑膜样品#3中测量的水平相当。在AAV5治疗组中，所有滑膜#1样品具有始终可检测的VG在3倍内）。然而，它们低于在滑膜#3中检测到的VG水平，因此证明了位置依赖性转导。[0194]通过定量载体来源的mRNA分析来自载体基因组的表达。对于滑膜样品#3，在AAV2处理的低、中和高组的25、45和45中检测到表达，而所有AAV5处理的关节具有可检测的mRNA拷贝（图5A。还在滑膜#1中检测到AAV5载体的载体表达，尽管水平较低，类似于在该位置处VG的检测减少（图5B^RNA的检测与VG检测有很好的相关性;将滑膜样品#3中每个单独注射的关节中的mRNA和VGDNA作为实例显示（图5C。[0195]犬软骨中的载体基因组检测。分析从股骨髁和胫骨坪收集的软骨样品以检测病毒基因组VG;图6A。将在每个单个注射的关节中检测到的载体DNA和mRNA以及股骨髁中的组平均值作为实例显示（图6B、C。数据显示AAV5载体以一致的方式存在于软骨中，并显示相当水平的载体来源的转录物。相当剂量的AAV2载体培养基）产生与AAV5载体相似的VG水平，但显示出低至约1100的mRNA水平。另外，AAV2VG拷贝似乎与载体剂量具有反向相关性。注射rAAV5的关节在从胫骨坪收集的软骨样品中还显示载体检测和表达，而在rAAV2处理的关节中未检测到所述载体及其表达（图6D。所有载体均导致对侧（未注射的）关节中载体DNA检测的最小量。[0196]滑膜和软骨结果概括于图7A中。对于滑膜基因转移，与AAV2载体相比，AAV5载体在两个滑膜样品位置中均导致高约10倍的载体DNA拷贝。通过AAV5引起的向软骨的基因转移为向滑膜的基因转移的120至110,而在滑膜和软骨中均观察到相似水平的AAV2载体基因组。图7B中概述了rAAV5载体来源的基因组和mRNA检测，在所有检查的组织样品中显示了一致的通过rAAV5HAS2载体的基因转移和表达。本申请人认为这个结果非常出乎意料。[0197]滑液中的HA水平分析。为了确定在rAAV载体施用后是否可以检测到滑液中HA水平的任何变化，定量第-7天基线）和第28天收集的样品中的滑膜HA水平。由于在动物中检测到高水平的变化，因此将每只动物的HA水平针对每只动物的基线水平进行标准化。数据显示，与经PBS处理的动物相比，AAV2高和AAV5中剂量平均升高滑液中的HA水平（图8A和8B〇[0198]实施例Id-结论[0199]为了在体内在关节中提供HA的过表达，本申请人产生了具有两种衣壳血清型的rAAV载体。AAV衣壳血清型的选择是重要的，因为靶物种中任何预先存在的中和抗体可中和治疗性载体并因此阻断rAAV载体的基因转移。本文公开的结果显示，所分析的大多数狗具有低水平的针对AAV2和AAV5衣壳的中和抗体。因此，本申请人在关节内注射后直接在靶组织（即犬膝关节）中测试AAV2和AAV5衣壳定位。由于预期HA表达对滑膜细胞和软骨细胞都有益，因此分别定量犬滑膜和软骨样品中的载体基因组拷贝。数据显示，AAV2在体内对犬滑膜和软骨组织提供了非常不一致的基因转移，并且几乎没有剂量-反应效应，其原因尚不清楚。在兔OA关节中进行的类似实验用可比较的载体剂量证明了非常一致的rAAV2载体基因组检测Kyostio-Moore2015。与AAV2载体相反，在两种组织类型η=5组）中均以一致的方式检测到AAV5载体基因组。[0200]重要的是，软骨样品中AAV5的检测是令人惊讶和出乎意料的，因为据报道软骨由于广泛的细胞外基质而在体内条件下难以转导，并且目前没有关于在关节内递送后在大型动物的软骨中检测到AAV5的其他报道。另外，现在公开的犬研究在犬滑膜组织中产生了不可预测的高水平的rAAV5载体，与软骨中的rAAV5载体水平相比，滑膜中的rAAV5载体水平也高出约2个对数，表明AAV5偏好犬滑膜衬里。这种偏好表达模式同样在本公开之前无法预测。[0201]除了检测高水平的载体以外，还通过mRNA分析在犬滑膜和软骨组织中确认了重组HAS2表达，表明CBA启动子在两种组织类型中都是有功能的。另外，在软骨样品中检测到AAV5的转录物证实了软骨细胞被载体转导而非被隔离在软骨的细胞外基质中的病毒转导。对于AAV2,在滑膜衬里中也观察到相当水平的载体基因组和转录物。然而，来自AAV2载体的mRNA表达令人惊讶地为软骨样品中相应载体基因组的检测的约1100,表明一些载体保留在软骨细胞外，可能保留在细胞外基质中。只有在本申请人进行了重要的非常规实验后才能理解这些关键差异。[0202]尽管只向每只动物中的一个关节施用载体，但偶尔在对侧未注射的关节中检测到载体基因组。这主要在从AAV2处理的关节获得的滑液样品中观察到。然而，在对侧关节中观察到载体基因组的动物在这些关节中均不具有任何可检测的HAS2转录物。[0203]总之，本文公开的数据表明AAV5衣壳通过关节内递送至犬关节提供良好的基因转移。这基于受试者中低的预先存在的对AAV5的体液免疫力和在关节内注射后转导关节组织的能力。至关节内的注射不仅可以提供向滑膜衬里的基因转移，还可以提供向软骨的软骨细胞的基因转移。两种组织类型都将受益于由所公开的基因递送组合物和方法提供的增加的HA合成:滑膜，受益于增强的在滑液中提供润滑的能力；软骨，通过用作支架用于增强基质附着从而改善软骨健康。这些结果表明，通过AAV介导的HAS2基因向疾病部位的转移产生的HA过表达将减轻OA病理学和疼痛。[0204]实施例2-润滑素AAV载体的构建和评估[0205]实施例2a_概述[0206]最近，已证明重组润滑素蛋白的关节内注射减少了大鼠OA模型中的软骨退化Flannery2006。然而，施用于关节内的重组润滑素在滑液中具有非常短的半衰期，其中大部分蛋白质在72小时内被清除Vugmeyster2011。因此，需要重复的关节内注射，这是费力的、有压力的和昂贵的。与HAS2相反参见实施例1，润滑素由大的cDNA编码并且在其粘蛋白样结构域中含有多个DNA重复，使得其难以相应地装入rAAV载体和高水平表达。为了避免该问题，本申请人产生了缩短的犬润滑素cDNA来优化小的表达盒以增加润滑素产生。重要的是，在本公开之前，全长犬润滑素序列和本文公开的缩短形式都是未知的。[0207]简言之，本申请人产生了全长犬润滑素的cDNA，其随后被用于设计犬润滑素的缩短和密码子优化的形式cLublco。然后将后者用于构建表达各种润滑素的质粒。在转染入HEK293细胞后，表征质粒的润滑素mRNA和蛋白质产生。数据显示每种构建体均产生润滑素mRNA和分泌的润滑素。最后，本申请人用cLubl表达盒产生rAAV载体并证明了rAAVcLubl载体产生的可行性。用该构建体感染的HEK293细胞合成并分泌犬润滑素。[0208]实施例2b_方法[0209]犬润滑素的克隆。由于GenBank不完整序列=GenBank号ABD38836.1中不存在犬全长润滑素cDNA，因此从定制合成的犬软骨cDNA文库中获得完整的犬cDNA。为实现该目的，使用qPCR和各种引物产生重叠片段。然后将全长cDNASEQIDN0:4用于设计犬润滑素cLubl的缩短形式，其类似于公开的较短版本的人润滑素Flannery2009。该较短的犬润滑素在编码氨基酸378至782的序列中含有缺失。对缩短的润滑素序列进行密码子优化cLublco并合成其GeneArtInvitrogen。将cLubco片段KpnI平端化至PmeI克隆入含有CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和缩短的杂合内含子HIbminCBA和牛生长激素BGH多聚腺苷酸化pA位点的质粒的Mfe平端化的）-PmeI位点。将连接反应物转化至大肠杆菌E.coli稳定II细胞中并在30°C下生长以使DNA重排最小化。通过限制性内切酶分析来分析所得的克隆，并通过DNA测序分析克隆连接。产生另外的构建体，其含有6x组氨酸6xHis密码子和存在于内含子序列中的两个“ATG”序列中的修饰。表达质粒用于体外分析润滑素表达。[0210]犬润滑素的表达分析。使用Lipofectamine2000Invitrogen将润滑素表达质粒转染到HEK293细胞中，并使细胞生长72小时。为了分析润滑素mRNA表达，收集细胞并使用对BGHpA特异的引物探针通过实时（RTqPCR测定来测量转录物水平（7500实时PCR系统；AppliedBiosystems，FosterCity，CA。为了分析蛋白质产量，收集培养基并浓缩约20至30倍（100kMffCO过滤器，Millipore。将样品分别在MOPS或Tris-乙酸盐缓冲液中的4-12%Bis-Tris凝胶或3_8%Tris-乙酸盐（NuPAGE;ThermoFisherScientificSDS-PAGE凝胶还原的）上运行。使用小鼠抗-润滑素抗体9G3，MilliporeAi2015和山羊抗小鼠-HRP作为二抗（JacksonImmunoResearchLaboratories,WestGrove,PA通过Western印迹检测润滑素。[0211]AAVcLublco的产生。将cLubl表达盒克隆入含有AAV反向末端重复序列（ΙΊΈ的质粒中，以产生侧翼连接有AAVITR前病毒质粒pDC627的表达盒，以构建psITRminCBA-HI-cLublco-BGHpA。为了测试含有cLubl表达盒的质粒的包装，将293细胞以8xl05个细胞孔6孔板接种，第二天用psITRminCBA-HI-cLublco-BGHpA或psp70EGFP、pHLP-19cap2AAV2或p5repCMVcap5AAV5质粒和pAdHELPPromegaCaP〇4试剂盒转染，以将载体包装到AAV2或AAV5衣壳中。3天后收集细胞，使用对BGHpA序列特异的引物探针（AppliedBiosystemsLifeTechnologies和连续稀释的含有BGHpA的线性化质粒DNA的标准曲线，通过qPCR测定7500实时PCR系统定量裂解物的载体产量。rAAV病毒产量表示为每个细胞的DNA酶抗性颗粒DRP的量Clark1999。[0212]使用PSITRminCBA-HI-cLublc〇-BGH、pHLP19-cap5对于AAV5载体）和pAdHELP的三重转染进行研究规模载体生产。通过CsCl梯度纯化载体，并如上所述UniversityofMassachusettsMedicalSchool,Worcester,MA对产量进行定量。[0213]实施例2c_结果[0214]短的犬润滑素的产生。由于GenBank中存在的犬润滑素序列缺失了大部分外显子6编码857个氨基酸），因此产生全长犬润滑素cDNA4017bp，不包括终止密码子;SEQIDNO:4，其编码具有总共1339个氨基酸的蛋白质（SEQIDN0:5;图9，其略微小于1404个氨基酸的人序列。在氨基酸水平，犬润滑素序列与人润滑素（SEQIDN0:11;图16具有79%同一性。[0215]由于包装限制，全长犬润滑素太大而不能被装入rAAV载体中，因此产生了缩短形式的犬润滑素。通过缺失编码粘蛋白样结构域中的氨基酸378至782的序列产生这种较短形式的犬润滑素“Lubl”，并产生编码983个氨基酸（SEQIDN0:7的2949bp长的cDNASEQIDN0:6。尽管缺失了大部分粘蛋白样结构域，但仍保留了约10个KEPAPTT样肽重复序列。重要的是，这些都与经典的人重复序列不相同，但即使它们是相同的，技术人员也无法预测缩短的犬Lubll的递送在治疗OA方面是否有效。这些重复被认为对润滑性质很重要，因为它们是潜在的〇-连接的寡糖附接位点。该较短的润滑素Lublco;SEQIDNO:6的密码子优化使GC含量从44%增加至60%，并且与原始犬DNA序列具有74%的核苷酸相似性。然后将该较短的犬cDNA用于产生具有minCBA启动子、cLublco和BGHpA的质粒表达盒（图10。还制备了具有6xHiS-标签和内含子区域中推定的ATG核苷酸序列中的修饰（以最小化错误的翻译起始位点）的表达质粒。[0216]犬润滑素表达分析。通过证明转染的293细胞中mRNA水平升高，体外证实了来自最小CBA启动子minCBA-cLublco质粒的cLublco的表达（图11A。具有较短内含子的minCBA-cLublco构建体的活性低至使用全长CBA-HI构建体CBA-cLublco的约13。用含有全长润滑素和非密码子优化的构建体CBH-cLubr的质粒观察到非常少的转录。还对具有各种修饰的表达盒进行转录物分析（图10U1B。来自minCBA-Lublco的表达与EGFP和具有C末端6xHiS-标签的构建体的表达相当。缺失存在于杂合内含子中的推定的两个ATG密码子似乎使表达水平升高约2倍。在Lublco转染的细胞中观察到的另外的形态变化也表明Lubl表达，因为这些变化在未转染的细胞或EGFP-质粒转染的细胞中不存在未显示）。[0217]使用润滑素抗体通过Western印迹分析测试来自各种表达质粒的犬Lubl蛋白的产生，并在浓缩的培养基中显示了250-380kDa的蛋白质（图12A。基于1339个氨基酸的预期大小约为160kDa，但信号的较大和扩散模式可能归因于糖基化。在未转染的细胞或EGFP质粒转染的细胞中几乎观察不到检测。另外，AATG修饰似乎增加了润滑素的检测，类似于对于来自该构建体的升高的转录物水平所观察到的。还从前病毒AAV质粒确认了蛋白质表达，显示了相当的蛋白质检测（图12B。总之，这些结果证明了具有犬润滑素表达盒的质粒表达并分泌糖基化的润滑素蛋白。[0218]具有犬润滑素表达盒的rAAV载体的产生。在证实了来自质粒载体的犬润滑素表达后，我们接下来测试表达盒是否可在小规模包装实验中被包装到AAV2和AAV5衣壳血清型中图13A、B。数据显示AAV2和AAV5衣壳对犬润滑素的包装效率相当，如对于EGFP表达载体所观察到的。包含6xHis-标签不改变rAAV载体产量。对于具有犬HAS2表达盒的AAV2载体，测量至IJ低至约15的包装水平。然后进行AAV5minCBA-cLubl的研究规模生产以评估按比例放大的载体生产。载体产量与以EGFP作为转基因的标准AAV2和AAV5载体的载体产量相当（数据未显示）。然后在体外在HEK293细胞中测试rAAV5载体的润滑素产生和分泌。通过Western印迹分析条件培养基证明了犬润滑素的剂量依赖性检测（图14。总之，数据表明缩短形式的犬润滑素可用于产生rAAV载体，并且用该载体感染的细胞可介导润滑素合成和分泌到培养基中。[0219]实施例2d-结论[0220]如上所示，作为转基因的润滑素对rAAV产生提出了许多挑战。首先，具有必需表达元件的润滑素cDNA的大小超过rAAV包装能力，因此需要较短的cDNA形式。有趣的是，与粘蛋白样结构域中的人润滑素氨基酸序列相比，犬序列中不存在完美的KEPAPTT重复序列（图16。为了产生重组rAAV载体，任何重复的DNA序列都可能带来挑战，因为重复序列可通过在病毒产生过程中引起DNA缺失和重排而降低病毒基因组的稳定性和完整性。然而，所公开的并且令人惊讶的）结果表明，考虑到与标准EGFP报道载体相比获得了相当的载体产量，含有和表达新型犬润滑素序列的rAAV病毒的产生是可行的。此外，用所公开的载体感染的细胞均产生并分泌犬润滑素。因此，这是证明用于润滑素基因递送的单一rAAV载体策略的第一份报告。[0221]实施例3-在内侧半月板韧带释放MMR模型中进行的AAV-HAS2的体内功效研究[0222]本研究的目的是使用犬OA后膝关节模型的总体观察和组织学评估HA合酶-2基因疗法的功效。将12只为特定目的而饲养的首次接触实验的雄性杂种狗猎狐犬表型，〜20-23kg麻醉，并通过关节镜d-14完成右后膝关节的内侧半月板韧带释放MMI?。[0223]在第0天n=6只狗组关节内施用磷酸盐缓冲盐水PBS对照或5χ10η个携带犬透明质酸合酶2cHAS-2的重组AAV5的DNA酶抗性颗粒[drp]。[0224]在第0天和第182天从所有狗收集血浆用于关节炎症生物标志物水平分析。在第0天、第56天、第112天和第182天从所有PBC对照和cHAS-2处理组收集右侧和左侧滑液用于HA水平分析。[0225]在第182天对狗实施安乐死，并测量由半月板韧带释放诱导的软骨缺损通过印度墨水染色指示的），并根据由国际骨关节炎研究学会OARSI标准技术收集关节组织用于组织病理学。[0226]使用利用GraphPadPrism6统计软件的Kruskal-Wallis分析总体和组织学数据。[0227]测量滑液中的总HA水平，在总HA水平上未显示出任何处理相关的差异（图17。[0228]在第182天从处理的关节收集滑膜和软骨样品并分析病毒基因组的检测（图18A。在滑膜（图18A和大部分软骨（图18B样品中的每个单独的rAAV5cHAS-2注射关节中检测到载体来源的DNA和mRNA。数据概述于图18C中，显示了两种组织样品中载体基因组和mRNA的组平均值。[0229]没有证据表明局部或全身毒性与HA合酶-2基因疗法的关节内施用相关。与PBS处理相比，cHAS-2处理组中的软骨结构得到一致保持。在6只rAAV5cHAS2处理的狗的4只中，内侧股骨髁和内侧胫骨坪关节表面上的损伤的尺寸和深度减小更明显。[0230]在图19中，基于Cook等2001的组织病理学评分显示在每个内侧股骨髁和内侧胫骨软骨图像2x的左下角中。狗994731PBS向下广泛侵蚀至中间区域，其中两个软骨表面都有相当多的蛋白聚糖损失。未观察到软骨保护作用。用rAAV5cHAS2处理的狗993107在股骨软骨的浅表区域具有浅的病变，但总体而言，软骨的其余部分保持良好并且几无蛋白聚糖损失。胫骨坪病变深入至中间区域，具有中度蛋白聚糖消耗。在股骨髁中观察到软骨保护作用，因为下面的软骨相对正常。用rAAV5cHAS2处理的狗992879在股骨软骨中具有一定的蛋白聚糖损失，但整体形态得以保持。胫骨坪具有明确的局灶性侵蚀，但大部分软骨得以保持。因此，存在一些软骨保护的证据，因为病变较小且不太严重。[0231]值得注意的是，在软骨样品中没有可检测的载体的rAAV5处理动物之一也具有最大的胫骨坪病变区域狗993107,图19。相反，在滑膜和软骨中均检测到载体但在软骨中缺乏mRNA检测的rAAV5处理动物之一狗992879具有最佳的软骨结构。[0232]因此，rAAV5-HAS2载体的存在与最佳软骨结构相关，并且其缺失与最大的胫骨坪病变区域相关。因此，尽管载体mRNA检测存在差异，但表达HAS2的rAAV5载体似乎已引发所需的临床结果。[0233]综上所述，结果证实了至犬OA关节的滑膜和软骨中的一致的rAAV5介导的基因转移，并证明了持续至少6个月的持续的载体来源表达。组织学分析表明在大部分cHAS-2处理的关节中软骨病理学减轻并且疾病进展延迟，而在滑液中对于总HA水平几乎未观察到差异。后者可表明HA在软骨和滑膜组织中的局部表达具有一些疾病改善特性而不提高总滑液HA水平。或者，通过测量总HA水平无法检测的合成的HA的分子量变化也可能有助于rAAV5cHAS-2的有益作用。[0234]参考资料[0235]SandersonROetal.Systematicreviewofthemanagementofcanineosteoarthritis.VeterinaryRecord2009164,418-424[0236]McIlwraithCW.FrankMilneLecture:fromarthroscopytogenetherapy:30yearsoflookinginjoints.AmAssocEquinePract2005；51:65-113.[0237]Cooketal.TheOARSIhistopathologyinitiative-recommendationsforhistologicalassessmentsofosteoarthritisinthedog.OsteoarthritisCartilage,2010；18suppl3:S66-79.[0238]在以下编号的段落中进一步描述本发明：[0239]1.—种治疗患有骨关节炎OA的哺乳动物受试者的方法，其包括向所述哺乳动物受试者关节内施用治疗有效量的重组腺相关病毒rAAV，所述重组腺相关病毒包含与启动子可操作地连接的编码骨保护性或骨再生多肽的核酸，其中所述多肽在哺乳动物受试者中以有效减轻OA症状的量体内表达。[0240]2.段落1的方法，其中所述多肽是透明质酸合酶HAS、润滑素、白细胞介素-1受体IL-IR拮抗剂、胰岛素样生长因子IIGF-I、成纤维细胞生长因子2FGF-2、转化生长因子βΐTGFm、骨形态发生蛋白7BMP7、葡萄糖胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶GFAT、白细胞介素10IL-10、血红素加氧酶-1H0-1、其生物活性截短或其组合。[0241]3.段落1或2的方法，其中所述多肽是HAS2多肽。[0242]4.段落1-3中任一段的方法，其中所述哺乳动物受试者是人、犬或猫。[0243]5.段落1-4中任一段的方法，其中所述哺乳动物受试者是犬。[0244]6.段落5的方法，其中所述多肽是犬HAS2。[0245]7.段落5或6的方法，其中所述HAS2多肽包含与SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或在所述受试者中体内表现出体内HAS2活性的其片段、变体或其同系物。[0246]8.段落5-7中任一段的方法，其中所述HAS2多肽包含SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列。[0247]9.段落5-8中任一段的方法，其中所述编码HAS2多肽的核酸具有与SEQIDN0:3中所示的核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。[0248]10.段落5-9中任一段的方法，其中所述rAAV包含rAAV载体基因组，其从5’至3’包含以下元件:5’AAV反向末端重复序列（ITR、填充核酸、启动子、内含子IN、cHAS2密码子优化的〇0嫩、多聚腺苷酸化信号^和3^¥1丁1?。[0249]11.段落10的方法，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白（CBA启动子。[0250]12.段落1或2的方法，其中所述多肽是润滑素多肽。[0251]13.段落12的方法，其中所述润滑素多肽包含与SEQIDΝ0:7中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或在所述受试中体内表现出润滑素活性的其片段、变体或同系物。[0252]14.段落13的方法，其中所述润滑素多肽包含SEQIDΝ0:7中所示的氨基酸序列。[0253]15.段落13或14的方法，其中所述编码润滑素多肽的核酸具有与SEQIDΝ0:6中所示的核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。[0254]16.段落13-14中任一段的方法，其中所述rAAV包含由质粒pITRminCBA-HI-cLubIco-BGH编码的rAAV载体基因组。[0255]17.段落1-9或12-16中任一段的方法，其中所述启动子选自CMVIE启动子、RSV启动子、HSV-ITK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α-1抗胰蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、β-肌动蛋白基因启动子、CBA启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶CK基因启动子。[0256]18.段落1的方法，其中所述AAV包含AAV2或AAV5衣壳。[0257]19.—种增加犬的软骨细胞和或滑膜细胞中透明质酸产生的方法，其包括向所述犬施用rAAV的步骤，其中所述rAAV包含含有与启动子可操作地连接的编码HAS2酶的核酸的rAAV载体基因组，并且其中在施用后所述HAS2酶被表达并催化另外的透明质酸的产生，从而升高透明质酸HA在犬中的水平。[0258]20.段落19的方法，其中以足够的量产生所述HAS2以治疗犬的OA症状。[0259]21.段落20的方法，其中将所述HA水平恢复至在健康犬中发现的水平。[0260]22.—种治疗患有OA的犬的方法，其包括向所述犬施用治疗有效量的rAAV，其中所述rAAV包含含有与启动子可操作地连接的编码HAS2的核酸的AAV载体基因组。[0261]23.—种治疗患有OA的人的方法，其包括向所述人施用治疗有效量的rAAV，其中所述rAAV包含含有与启动子可操作连接的编码HAS2的核酸的AAV载体。[0262]24.段落19-23中任一项的方法，其中所述编码HAS2的核酸与SEQIDN0:3中所示的核苷酸序列具有至少90%同一性，或编码具有与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的HAS2。[0263]25.段落19-23中任一项的方法，其中所述HAS2具有SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列。[0264]26.—种增加犬的软骨细胞和或滑膜细胞中的润滑素产生的方法，其包括向犬施用rAAV的步骤，其中所述rAAV包含含有与启动子可操作地连接的编码润滑素的核酸的rAAV载体，并且其中在施用后表达所述润滑素，从而升高所述犬中的润滑素水平。[0265]27.段落26的方法，其中以足够的量产生所述润滑素以治疗犬的OA症状。[0266]28.段落26的方法，其中将所述润滑素水平恢复至健康犬中发现的水平。[0267]29.—种治疗患有OA的犬的方法，其包括向所述犬施用治疗有效量的rAAV，其中所述rAAV包含有与启动子可操作地连接的编码润滑素的核酸的rAAV载体基因组。[0268]30.—种治疗患有OA的人的方法，其包括向所述人施用治疗有效量的rAAV，其中所述rAAV包含含有与启动子可操作地连接的编码润滑素的核酸的AAV载体基因组。[0269]31.段落26-30中任一项的方法，其中所述编码润滑素多肽的核酸与SEQIDN0:6中所示的序列具有至少90%同一性，或者所述核酸编码具有与SEQIDNO:7中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的润滑素。[0270]32.段落26-30中任一项的方法，其中所述润滑素具有SEQIDN0:7中所示的氨基酸序列。[0271]33.段落19-32中任一项的方法，其中所述启动子选自CMVIE启动子、RSV启动子、HSV-ITK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α-l抗胰蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、CBA启动子、β-肌动蛋白基因启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶基因启动子。[0272]34.段落19-25中任一项的方法，其中所述rAAV包含由质粒Ps-AAV-ITRCBA-cHAS2c〇-BGH编码的rAAV载体基因组。[0273]35.段落26-32中任一段的方法，其中所述rAAV包含由质粒Ps-AAV-ITRminCBA-HI-cLubIco-BGH编码的rAAV载体基因组。[0274]36.—种预防处于其风险中的哺乳动物受试者中的OA发展的方法，其包括向所述犬施用治疗有效量的rAAV，其中所述rAAV包含含有与启动子可操作地连接的编码HAS2的核酸的rAAV载体基因组。[0275]37.段落36的方法，其中所述编码HAS2多肽的核酸与SEQIDN0:2中所示的序列具有至少90%同一性，或编码具有与SEQIDN0:2的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的HAS2。[0276]38.段落36或37的方法，其中所述HAS2多肽包含SEQIDN0:3中所示的氨基酸序列。[0277]39.—种预防处于其风险中的哺乳动物受试者的OA发展的方法，其包括向所述犬施用治疗有效量的rAAV，其中所述rAAV包含含有与启动子有效连接的编码润滑素的核酸的rAAV载体基因组。[0278]40.段落39的方法，其中所述编码润滑素的核酸与SEQIDN0:6中所示的序列具有至少90%同一性，或者所述核酸编码具有与SEQIDN0:7中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的润滑素。[0279]41.段落40的方法，其中所述润滑素多肽具有SEQIDN0:7中所示的氨基酸序列。[0280]42.段落36-38中任一项的方法，其中所述启动子选自CMVIE启动子、RSV启动子、HSV-ITK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α-l抗胰蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、CBA启动子、β-肌动蛋白基因启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶基因启动子。[0281]43.段落26的方法，其中rAAV包含由质粒Ps-AAV-ITRCBA-cHAS2c〇-BGH编码的rAAV载体基因组。[0282]44.段落26的方法，其中所述rAAV包含由质粒Ps-AAV-ITRminCBA-HI-cLublco-BGH编码的rAAV载体基因组。[0283]45.段落19-44中任一段的方法，其中关节内施用所述rAAV。[0284]46.—种重组质粒载体，其包含与启动子可操作地连接的编码犬HAS2多肽的核酸序列。[0285]47.段落46的重组质粒，其中编码HAS2多肽的核酸序列与SEQIDN0:3中所示的序列具有至少90%同一性，或者所述核酸编码包含与SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基序列的HAS2多肽。[0286]48.段落46或47的重组质粒，其中所述HAS2多肽包含SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列。[0287]49.段落46-49中任一段的重组质粒，其包含pCBA-HI-cHAS2-BGHpA。[0288]50.—种包含与启动子可操作连接的编码缩短的犬润滑素的核酸序列的重组质粒载体。[0289]51.段落50的重组质粒，其中所述编码润滑素的核酸序列与SEQIDN0:6中所示的核苷酸序列具有至少90%同一性，或者所述核酸编码包含与SEQIDNO:7中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的润滑素。[0290]52.段落50或51的重组质粒，其中所述润滑素多肽具有SEQIDN0:7中所示的氨基酸序列。[0291]53.段落46-49或50-52中任一段的重组质粒，其中所述启动子选自CMVIE启动子、RSV启动子、HSV-ITK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α-l抗胰蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、CBA启动子、β-肌动蛋白基因启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶基因启动子。[0292]54.—种包含SEQIDΝ0:8中所示的核苷酸序列的重组AAV5病毒载体。[0293]55.—种包含段落53的rAAV载体的rAAV。[0294]56.—种药物组合物，其包含段落55的rAAV，和至少一种药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。[0295]57.—种治疗患有骨关节炎的哺乳动物受试者的方法，其包括向所述哺乳动物受试者关节内施用治疗有效量的段落56的药物组合物。[0296]58.段落57的方法，其中所述哺乳动物受试者是人或犬科动物。[0297]59.—种基于腺相关病毒AAV的生物递送和表达系统，其用于通过在滑膜和或软骨细胞中长期基因表达HAS2或润滑素来治疗哺乳动物关节中的OA，其包括rAAV，其中所述rAAV包含rAAV载体，其包含编码HAS2或润滑素的核酸序列、左和右AAV反向末端重复序列LITR和RITR，并且其中HAS2或润滑素基因在滑膜和或软骨细胞内的表达受启动子调控，所述启动子位于编码HAS2或润滑素的核酸序列的阅读框架的上游，并且被升高水平的免疫刺激物质特异性激活。[0298]60.段落59的AAV系统，其中所述HAS2是哺乳动物HAS2。[0299]61.段落59或60的AAV系统，其中所述HAS2是人HAS2。[0300]62.段落59-61中任一段的AAV系统，其中所述启动子是炎症诱导型启动子。[0301]63.段落62的AAV系统，其中所述诱导型启动子选自：NF-kB启动子、白细胞介素6IL-6启动子、白细胞介素-IIL-I启动子、肿瘤坏死因子TNF启动子、环加氧酶2C0X-2启动子、补体因子3C3启动子、血清淀粉样蛋白A3SAA3启动子、巨噬细胞炎症蛋白-IaMIP-Ia启动子及其杂合构建体。[0302]64.根据段落59-63中任一段的AAV系统，其中所述rAAV载体基因组包含编码包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的HAS2、包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的润滑素或其功能变体的核酸。[0303]65.段落59-64中任一段的AAV系统，其中所述rAAV载体基因组包含允许监测滑膜和或软骨细胞中的载体基因组的标记基因。[0304]66.段落59-65中任一段的AAV系统，其中所述rAAV载体基因组包含与SEQIDN0:3或SEQIDN0:6中所示的核酸序列具有至少80%或90%序列同一性的核酸。[0305]67.段落59-66中任一段的AAV系统，其中所述rAAV载体基因组包含SEQIDN0:3或SEQIDNO:6中所示的核酸序列。[0306]68.段落59-67中任一段的AAV系统，其用于治疗或预防骨关节炎OA。[0307]69.—种药物组合物，其包含段落59-68中任一段的AAV系统。[0308]70.—种包含rAAV载体的rAAV，其中所述rAAV载体包含与启动子可操作地连接的编码犬HAS2多肽的核酸序列。[0309]71.段落70的rAAV，其中所述编码HAS2多肽的核酸序列与SEQIDN0:3中所示的序列具有至少90%的同一性，或者所述核酸编码包含与SEQIDN0:2所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的HAS2多肽。[0310]72.段落70或71的rAAV，其中所述HAS2多肽包含SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列。[0311]73.—种包含rAAV载体的rAAV，其中所述rAAV载体包含与启动子可操作连接的编码缩短的犬润滑素的核酸序列。[0312]74.段落73的rAAV，其中所述编码润滑素的核酸序列与SEQIDN0:6中所示的核苷酸序列具有至少90%同一性，或者所述核酸编码包含与SEQIDN0:7中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的润滑素。[0313]75.段落73或74的rAAV，其中所述润滑素多肽具有SEQIDN0:7中所示的氨基酸序列。[0314]76.段落50-53中任一段的rAAV，其中所述rAAV载体包含SEQIDNO:8中所示的核苷酸序列。[0315]77.段落71-72或74-76中任一项的rAAV，其中所述启动子选自CMVIE启动子、RSV启动子、HSV-ITK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α_1抗膜蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、CBA启动子、β-肌动蛋白基因启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶基因启动子。[0316]78.段落71-77中任一段的rAAV，其中所述rAAV包含AAV2衣壳或AAV5衣壳。[0317]79.—种药物组合物，其包含段落71-78中任一项的rAAV，和至少一种药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。[0318]80.—种治疗患有骨关节炎的哺乳动物受试者的方法，其包括向所述哺乳动物受试者关节内给予治疗有效量的段落79的药物组合物。[0319]81.段落80的方法，其中所述哺乳动物受试者是人或犬科动物。[0320]82.—种具有SEQIDN0:4中所示的序列的分离的核酸。[0321]83.—种具有SEQIDN0:5中所示的序列的分离的多肽。[0322]现在将根据以下一组非限制性权利要求来详述本发明。

权利要求：1.一种包含rAAV载体的重组腺相关病毒rAAV，其中所述rAAV载体包含与启动子可操作连接的编码犬HAS2多肽的核酸序列。2.权利要求1的rAAV，其中所述编码HAS2多肽的核酸序列与SEQIDNO:3中所示的序列具有至少90%同一性，或者所述核酸编码包含与SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的HAS2多肽，或者其中所述HAS2多肽包含SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列；和或所述重组质粒包含pCBA-HI-cHAS2-BGHpA。3.—种包含rAAV载体的rAAV，其中所述rAAV载体包含与启动子可操作连接的编码缩短的犬润滑素的核酸序列。4.权利要求3的rAAV，其中所述编码润滑素的核酸序列与SEQIDN0:6中所示的核苷酸序列具有至少90%同一性，或者所述核酸编码包含与SEQIDN0:7中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的润滑素。5.权利要求3或4的rAAV，其中所述润滑素多肽具有SEQIDN0:7中所示的氨基酸序列。6.权利要求3至5中任一项的rAAV，其中所述rAAV载体包含SEQIDN0:8中所示的核苷酸序列。7.权利要求1至6中任一项的rAAV，其中所述启动子选自CMVIE启动子、RSV启动子、HSV-ITK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α-l抗胰蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、CBA启动子、β-肌动蛋白基因启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶基因启动子。8.权利要求1至7中任一项的rAAV，其中所述rAAV包含AAV2衣壳或AAV5衣壳。9.权利要求8的rAAV，其中所述rAAV包含AAV5衣壳。10.—种药物组合物，其包含权利要求1至9中任一项的rAAV和任选地至少一种药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。11.一种治疗患有骨关节炎OA的哺乳动物受试者的方法，其包括向所述哺乳动物受试者关节内施用治疗有效量的重组腺相关病毒rAAV，所述重组腺相关病毒包含与启动子可操作地连接的编码骨保护性或骨再生多肽的核酸，其中所述多肽在所述哺乳动物受试者中以有效减轻OA症状的量体内表达；其中所述多肽是透明质酸合酶HAS、润滑素、白细胞介素-1受体IL-IR拮抗剂、胰岛素样生长因子IIGF-I、成纤维细胞生长因子2FGF-2、转化生长因子βΐTGFm、骨形态发生蛋白7BMP7、葡萄糖胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶GFAT、白细胞介素10IL-10、血红素加氧酶-1H0-1、其生物活性截短或其组合。12.权利要求11的方法，其中所述多肽是HAS2多肽。13.权利要求11或12的方法，其中所述HAS2多肽包含与SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列或在所述受试者中在体内表现出HAS2活性的其片段、变体或同系物。14.权利要求11-13中任一项的方法，其中所述HAS2多肽包含SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列。15.权利要求11-14中任一项的方法，其中所述编码HAS2多肽的核酸具有与SEQIDNO:3中所示的核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列；以及其中所述rAAV包含rAAV载体基因组，其从5’至3’包含以下元件:5’AAV反向末端重复序列（ITR、填充核酸、启动子、内含子IN、cHAS2密码子优化的cDNA、多聚腺苷酸化信号pA和3,AAVITR0

百度查询： 勃林格殷格翰动物保健美国公司;根茨美公司 用于治疗哺乳动物内骨关节炎和相关关节病症的表达骨保护性基因、包括HAS2和润滑素的重组AAV载体

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