申请/专利权人：广东省农业科学院作物研究所

申请日：2023-11-24

公开（公告）日：2024-03-01

公开（公告）号：CN117286181B

主分类号：C12N15/84

分类号：C12N15/84;C12N15/64;C12N15/55;C12N15/113;A01H5/00;A01H6/50;C12Q1/6895;C12N15/11;A01H4/00

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.01#授权;2024.01.12#实质审查的生效;2023.12.26#公开

摘要：一种CRISPRCas9介导的四倍体广藿香高效靶向诱变的基因编辑系统，涉及CRISPRCas9介导的基因组编辑系统在四倍体广藿香中靶向诱变的应用，属于植物基因工程技术领域。其中PcUbi‑pEGCas9基因编辑重组载体转化的农杆菌介导的广藿香遗传转化方法，包括如下步骤：农杆菌转化、侵染液制备、预培养、侵染、共培养、洗菌、抗性愈伤筛选、分化筛选、生根培养。本发明提供的CRISPRCas9介导的基因组编辑系统在四倍体栽培种广藿香中具有高效的靶向突变能力，突变类型丰富，技术完善，为广藿香的分子育种和功能基因组的研究提供良好的技术支撑，也可以作为基因操纵工具广泛应用于提高广藿香中的有效活性成分。

主权项：1.一种PcUbi-pEGCas9基因编辑重组载体转化的农杆菌介导的广藿香遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）农杆菌转化将PcUbi-pEGCas9质粒转化到根癌农杆菌GV3101感受态细胞中；所述PcUbi-pEGCas9质粒包含如下基因片段：来自花椰菜花叶病毒的35S启动子CaMV35S、除草剂basta抗性基因BlpR、终止子CaMVpolyA、来自欧芹的泛素启动子PcUbi、翻译增强子TMVΩ、用来增强真核基因翻译效率的Kozak序列、核酸内切酶基因Cas9、核定位信号元件SV40NLS、终止子E9terminator、拟南芥AtU6-1启动子、包含PatPDS基因编辑靶位点T1的表达盒sgRNA1、拟南芥AtU6-29启动子以及包含PatPDS基因编辑靶位点T2的表达盒sgRNA2；所述表达盒sgRNA1的序列5'-3'为：AGAAATCTCAAAATTCCGGCAGAACAATTTTGAATCTCGATCCGTAGAAACGAGACGGTCATTGTTTTAGTTCCACCACGATTATATTTGAAATTTACGTGAGTGTGAGTGAGACTTGCATAAGAAAATAAAATCTTTAGTTGGGAAAAAATTCAATAATATAAATGGGCTTGAGAAGGAAGCGAGGGATAGGCCTTTTTCTAAAATAGGCCCATTTAAGCTATTAACAATCTTCAAAAGTACCACAGCGCTTAGGTAAAGAAAGCAGCTGAGTTTATATATGGTTAGAGACGAAGTAGTGATTGATTCCAGCTGCGCGTGCTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC；所述表达盒sgRNA2的序列5'-3'为：AAAATATCAGAGATCTCTTACAGTTAGTTTCGTTCTTAATCCAAACTACTGCAGCCTGACAGACAAATGAGGATGCAAACAATTTTAAAGTTTATCTAACGCTAGCTGTTTTGTTTCTTCTCTCTGGTGCACCAACGACGGCGTTTTCTCAATCATAAAGAGGCTTGTTTTACTTAAGGCCAATAATGTTGATGGATCGAAAGAAGAGGGCTTTTAATAAACGAGCCCGTTTAAGCTGTAAACGATGTCAAAAACATCCCACATCGTTCAGTTGAAAATAGTAGCTCTGTTTATATATTGGTAGAGTCGACTAAGAGATTGTGTTATCAAGCTCTGGTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC；（2）侵染液制备将转化后的农杆菌接种于1mL添加有50mgL卡那霉素、25mgL利福平和50mgL庆大霉素的YEB液体培养基中，在28℃、200rpm的摇床中振荡过夜培养；将所有培养物转移至100mL含有50mgL卡那霉素、25mgL利福平和50mgL庆大霉素的YEB液体培养基中，培养至OD600达到0.6～0.8，5000rpm离心5min收集农杆菌细胞；将沉淀的细胞重新悬浮在等体积的侵染培养基中，孵育2h以激活毒性基因用于侵染转化；（3）预培养将诱导的胚性愈伤组织转移至预培养培养基中，25℃暗培养2d；（4）侵染将预培养后的胚性愈伤组织转移到侵染培养基中，100个外植体50mL侵染培养基，置于90rmin摇床中，于28℃震荡20～30min，使预培养的外植体与转化后的农杆菌之间能够充分的接触；（5）共培养侵染结束后，用无菌滤纸将侵染后的胚性愈伤组织上的菌液吸干，然后转接到共培养培养基中，在25℃暗培养条件下培养2～3d；（6）洗菌将在共培养过程中形成菌斑的愈伤组织用含有300mgL头孢霉素和200mgL特美汀的无菌水清洗2～3遍，然后再用无菌滤纸吸干表面的水分；（7）抗性愈伤筛选将愈伤组织转接到抗性愈伤筛选培养基，25℃暗培养，每隔2周继代培养一次，连续继代2-3次筛选出抗性愈伤组织；（8）分化筛选将上述抗性愈伤组织转移至分化筛选培养基，在28℃、168h明暗光周期下诱导不定芽分化，每隔2周继代一次诱导不定芽；（9）生根培养当芽长到2～3cm时，将其转移到诱导生根培养基中诱导生根；所述PcUbi-pEGCas9质粒的制备方法如下：（S1）四倍体广藿香PatPDS基因的核苷酸序列特征分析和扩增以四倍体广藿香的基因组DNA为模板，采用引物组合PatPDS-FPatPDS-R通过PCR扩增四倍体广藿香五个拷贝的PatPDS等位基因；所述PatPDS-F的序列5'-3'为ATGATGTCTCAATTTGGGCAC；所述PatPDS-R的序列5'-3'为TTAGGCGTAGCTTGCCTCT；PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并通过琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收；将纯化回收的PCR产物通过TOPO克隆试剂盒连接到pCE2_TA-Blunt-Zero载体得到重组的pCE2_TA-Blunt-Zero载体；采用热激法将重组的pCE2_TA-Blunt-Zero载体转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，经氨苄青霉素和卡那霉素筛选后，挑取阳性单克隆进行测序，得到四倍体广藿香PatPDS基因五个拷贝的核苷酸序列；（S2）PatPDS基因编辑重组载体的构建（S2.1）基因编辑重组载体靶位点的筛选根据四倍体广藿香PatPDS基因五个拷贝的核苷酸序列，选择在PatPDS等位基因的5'端保守区附近的两个靶位点，分别是位于第一外显子的靶位点T1和位于第二外显子的靶位点T2；所述靶位点T1的序列5'-3'为ATTCCAGCTGCGCGTGCTTTTGG；所述靶位点T2的序列5'-3'为CCACGACCAGAGCTTGATAACAC；（S2.2）第一轮PCR扩增以pU6为模板，通过引物组合U-FAtU6-1-R扩增AtU6-1启动子，通过引物组合U-FAtU6-29-R扩增AtU6-29启动子；以sgRNA为模板，通过引物组合gRT1gRNA-R将靶位点T1连接到gRNA，得到gRNA1，通过引物组合gRT2gRNA-R将靶位点T2连接到gRNA，得到gRNA2；第一轮PCR扩增的引物序列如下：所述U-F的序列5'-3'为CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG；所述AtU6-1-R的序列5'-3'为AAAGCACGCGCAGCTGGAATCaatcactacttcgtct；所述AtU6-29-R的序列5'-3'为CGACCAGAGCTTGATAACACaatctcttagtcgact；所述gRT1的序列5'-3'为ATTCCAGCTGCGCGTGCTTTgttttagagctagaaat；所述gRT2的序列5'-3'为TGTTATCAAGCTCTGGTCGgttttagagctagaaat；所述gRNA-R的序列5'-3'为CGGAGGAAAATTCCATCCAC；（S2.3）第二轮PCR扩增以AtU6-1和gRNA1为模板，采用引物组合Pps-1Pgs-1通过重叠PCR扩增含有步骤（S2.2）中AtU6-1启动子和gRNA1的表达盒sgRNA1；以AtU6-29和gRNA2为模板，采用引物组合Pps-2Pgs-2通过重叠PCR扩增含有步骤（S2.2）中AtU6-29启动子和gRNA2的表达盒sgRNA2；第二轮PCR扩增的引物序列如下：所述Pps-1的序列5'-3'为TTCAGAggtctcTaccgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG；所述Pgs-1的序列5'-3'为AGCGTGggtctcGtcagggTCCATCCACTCCAAGCTC；所述Pps-2的序列5'-3'为TTCAGAggtctcTctgacacTGGAATCGGCAGCAAAGG；所述Pgs-2的序列5'-3'为AGCGTGggtctcGctcgACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC；第二轮PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并通过琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收表达盒sgRNA1和表达盒sgRNA2；（S2.4）将表达盒sgRNA1和表达盒sgRNA2与pEGCas9-PcUBI-B载体连接；（S2.5）基因编辑重组载体阳性克隆的筛选及鉴定将步骤（S2.4）获得的连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，使用引物组合E9Ter-FSP-R进行菌落PCR检测，引物序列如下：所述E9Ter-F的序列5'-3'为TGGATTTGTAGTTGAGTATGAA；所述SP-R的序列5'-3'为TGCAATAACTTCGTATAGGC；将检测为阳性的单克隆进行测序，将测序得到的核苷酸序列与表达盒sgRNA1的核苷酸序列和表达盒sgRNA2的核苷酸序列进行比对，将含有表达盒sgRNA1和表达盒sgRNA2的重组载体pEGCas9-PcUBI-B的单菌落培养后提取质粒备用，该质粒即为PcUbi-pEGCas9。

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