申请/专利权人：猎源(上海)生物医药科技有限公司

申请日：2018-10-29

公开（公告）日：2024-03-08

公开（公告）号：CN111100839B

主分类号：C12N5/09

分类号：C12N5/09

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.08#授权;2020.05.29#实质审查的生效;2020.05.05#公开

摘要：本发明提供了一种EGFRVimentin叶酸免疫脂质体磁球、其制备方法及试剂盒。本发明提供的EGFRVimentin叶酸免疫脂质体磁球，用于捕获非小细胞肺癌患者的外周血中的循环肿瘤细胞，该EGFRVimentin叶酸免疫脂质体磁球连接有EGFR抗体、Vimentin抗体以及叶酸，因此能够对非小细胞肺癌患者的外周血中的CTC进行快速富集分离，能够解决现有技术中CellSearch因不能够捕获缺乏EpCAM蛋白的CTC或已经发生上皮间质转化的CTC而造成的大量检测假阴性问题，因而能够用于CTC的鉴定、分析并提高CTC鉴定的精确度，极具临床应用价值。

主权项：1.一种非小细胞肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，用于检测已经脱离肺部进入外周血中的循环肿瘤细胞，其特征在于，包括：EGFRVimentin叶酸免疫脂质体磁球，用于捕获非小细胞肺癌患者的外周血中的循环肿瘤细胞，该EGFRVimentin叶酸免疫脂质体磁球连接有EGFR抗体、Vimentin抗体以及叶酸，所述EGFR抗体、Vimentin抗体以及叶酸的质量比为EGFR抗体：Vimentin抗体：叶酸＝1:1:1；第一固定液，用于对捕获了所述循环肿瘤细胞的EGFRVimentin叶酸免疫脂质体磁球进行第一次细胞固定，所述第一固定液包括体积分数为4％的多聚甲醛；第一染色剂，用于对经过第一次固定的所述循环肿瘤细胞进行第一次染色，所述第一染色剂包括DAPI、CK19-FITC以及CD45-PE；第二固定液，用于对经过第一次染色后的所述循环肿瘤细胞进行第二次固定，所述第二固定液包括质量浓度为0.01％～0.04％的琼脂糖溶液；以及第二染色剂，用于对经过第二次固定的所述循环肿瘤细胞进行第二次染色，所述第二染色剂包括苏木精和伊红，其中，所述EGFRVimentin叶酸免疫脂质体磁球通过以下制备方法制成：步骤一，按EGFR抗体：Vimentin抗体：叶酸：GHDC＝1:1:1:1～1:1:1:10的质量比，将EGFR抗体、Vimentin抗体、叶酸以及GHDC共溶于磷酸缓冲液中，在预定温度下磁力搅拌反应过夜，获得第一溶液；步骤二，用分子量为8000～14000道尔顿的透析袋对所述第一溶液进行预定时间的透析，透析后进行冻干得到抗体衍生物，该抗体衍生物包括EGFR-GHDC、Vimentin-GHDC以及FA-GHDC；步骤三，按HQCMC：胆固醇＝1：0.5～1：5的质量比，将HQCMC和胆固醇混合，获得混合物；步骤四，按去乙醇后的磁珠溶液：CH2Cl2＝1：1～1：5的体积比，将去乙醇后的磁珠溶液溶解于CH2Cl2，获得第二溶液；步骤五，按所述第二溶液：所述混合物＝1：1～1：5的体积质量比，将所述第二溶液加入所述混合物中，获得第三溶液；步骤六，将所述第三溶液在冰浴下乳化2min～20min，并在乳化时把溶于水的所述抗体衍生物按所述磁珠溶液：所述抗体衍生物＝1：1～1：5的体积质量比，加入正在乳化的所述第三溶液中，乳化完成后得到第四溶液；步骤七，去除所述第四溶液中残留的CH2Cl2，得到第五溶液；步骤八，将所述第五溶液进行磁分离并洗涤后，获得EGFRVimentin叶酸免疫脂质体磁球，步骤一中，所述预定温度为2～8℃，步骤二中，所述预定时间为10h～14h，步骤六中，所述乳化为超声乳化。

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