申请/专利权人：中国科学院大连化学物理研究所

申请日：2020-11-30

公开（公告）日：2024-03-08

公开（公告）号：CN114573706B

主分类号：C07K17/08

分类号：C07K17/08;G01N33/68

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.08#授权;2022.06.21#实质审查的生效;2022.06.03#公开

摘要：本发明涉及一种用于靶向叶绿体的包裹有交联剂的转运载体的研制及其应用方法。采用纳米沉淀、乳液聚合的方法，以生物相容性较好的聚乙二醇及聚乳酸‑羟基乙酸为原料制备转运载体，将交联剂包裹于其中，通过信号肽作用将交联剂靶向递送至植物细胞中的叶绿体内并释放，提取相互作用的蛋白质复合物，再经点击化学及富集，结合质谱技术，实现细胞器内蛋白质复合物的原位交联。该种材料解决了交联剂跨植物细胞膜实现原位交联的障碍,为后期光合作用相关蛋白质复合物的原位分析奠定了基础。

主权项：1.一种靶向叶绿体的包裹有交联剂的转运载体，其特征在于：以聚（乳酸-羟基乙酸）和聚乙二醇为载体材料，以双十二烷基二甲基溴化铵使载体外表呈正电，并将交联剂包裹于其中；再经叶绿体信号肽修饰获得；所包裹的交联剂包括：其两侧中的一侧或二侧为具有可与蛋白中的氨基反应的琥珀酰亚胺基团的化合物，琥珀酰亚胺酯具有胺类反应活性和强交联能力；或两侧中的一侧或二侧为具有可与伯氨和或仲氨反应产生稳定的酰胺和或亚酰胺基团的化合物；包裹有交联剂的转运载体的制备过程为，A、通过乳液聚合法制备包裹有交联剂的转运载体，其步骤包括：（1）将聚（乳酸-羟基乙酸）、聚乙二醇、交联剂和带正电作用的双十二烷基二甲基溴化铵溶于油相中；（2）将油相分散于水中，油相与水的体积比范围为1:5-1:10，载体材料在水相中自组装形成乳胶粒；（3）将在水相中自组装形成的乳胶粒,搅拌15min-1h，液滴固化稳定，形成载体悬浊液；（4）将悬浊液通过离心作用16000-20000gmin，15-40min去除水及油相，沉淀经干燥，得到载体颗粒；（5）：在载体表面偶联信号肽，将信号肽和载体溶于二甲基甲酰胺中，避光室温摇床反应24-48小时，16000-20000gmin，离心30-40分钟，得到载体颗粒，用水清洗1-3遍，16000-20000gmin，离心30-40分钟，取得沉淀后干燥得到载体颗粒；或B、通过纳米沉淀法制备交联转运载体，其步骤包括：（1）将带正电作用的双十二烷基二甲基溴化铵、交联剂、聚（乳酸-羟基乙酸）和聚乙二醇溶于油相中；（2）将油相逐滴加入水中，油相与水的体积比范围为1:5-1:10，搅拌15min-1h，固化；（3）30℃蒸发5-15min，去除油相；（4）通过离心12000-20000gmin，15-40min去除多余水，最后干燥得到载体颗粒；（5）在载体表面偶联信号肽，将信号肽和载体溶于二甲基甲酰胺中，避光室温摇床反应24-48小时，12000-20000gmin，离心30-40分钟，得到载体颗粒，用水清洗1-3遍，12000-20000gmin，离心30-40分钟，取得沉淀后干燥得到载体颗粒；聚乙二醇的分子量为5000-10000，聚（乳酸-羟基乙酸）的分子量为2000-5000，聚（乳酸-羟基乙酸）中乳酸羟基乙酸摩尔比为5050；聚（乳酸-羟基乙酸）和聚乙二醇的质量比为4:1-9:1，油相为二氯甲烷和或乙腈；聚（乳酸-羟基乙酸）于油相中质量浓度3-15mgml，双十二烷基二甲基溴化铵于油相中质量浓度0.7-1.8mgml；交联剂于油相中质量浓度1.5-5mgml。

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