申请/专利权人：苏州吉美瑞生医学科技有限公司

申请日：2019-05-16

公开（公告）日：2024-03-12

公开（公告）号：CN114196613B

主分类号：C12N5/071

分类号：C12N5/071;A61K35/42;A61P11/08

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.12#授权;2022.04.05#实质审查的生效;2022.03.18#公开

摘要：本发明公开了一种临床级自体支气管基底层细胞制备方法以及细胞回输制剂在治疗支气管扩张中的应用。制备方法包括：取离体活性支气管刷检组织进行消化处理，终止消化后收集细胞；利用铺被滋养层细胞的培养板对消化后细胞进行铺板培养，收集细胞并利用铺被滋养层细胞的培养板对其进行扩增培养，待细胞长满至培养板表面积的50％‑90％时，进行传代培养。本发明首次确定适用于肺脏损伤修复的临床级细胞，制备工艺实现了该细胞的工业化制备，可在短期内获得满足临床细胞治疗数量和质量的支气管基底层细胞，该方法制得的支气管基底层细胞进入病灶后可稳定分化，实现对支气管扩张病灶的修复，有效改善肺通气功能和换气功能、修复受损肺结构、促进肺结构新生。

主权项：1.一种临床级自体支气管基底层细胞的制备方法在制备治疗支气管扩张的药物中的应用，其特征在于，所述临床级自体支气管基底层细胞的制备方法包括如下步骤：组织准备：取离体活性支气管刷检组织备用；酶解：对上述组织进行消化处理，终止消化后收集细胞；铺板、扩增培养：取部分经消化处理后的细胞，利用铺被滋养层细胞的培养板对细胞进行铺板培养，收集细胞并利用铺被滋养层细胞的培养板对其进行扩增培养，待细胞长满至培养板表面积的50％-90％时，进行传代培养；收集细胞：待传代培养细胞长满至培养皿表面积的85％-95％时，消化并收集贴壁细胞，洗涤即可；所述消化处理所用的组织消化液包含99v％的DMEMF12，1-20ngmL的DNA酶，0.1-4mgmL蛋白酶XIV和10-200ngmL胰酶；所述消化处理的温度为37℃，时间为0.5-2h；所述终止消化所用的终止液包含90v％DMEM和10v％FBS；铺板培养包括以下步骤：取待进行铺板培养的细胞，用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的培养板中，培养板中加入抗生素；在37℃，CO2浓度为4％-8％条件下培养，隔天更换培养基，待细胞呈克隆状生长至细胞聚集成团，细胞克隆长大至超过80％的克隆中有40-100个细胞，且随机观察的5个视野中有3个视野均有A级和B级克隆时，收集细胞；所述A级克隆轮廓规则圆滑，克隆边界清晰，克隆内细胞排列紧致，大小均一；所述B级克隆轮廓基本规则，克隆边界平滑清晰，克隆内细胞大部分紧致均一，有少量细胞体积稍大，排列略显疏松；所述传代培养为n次n大于1且不大于7，其中，利用铺被滋养层细胞的培养皿进行n-1次传代培养，至n-1次传代培养后细胞长满至培养皿表面积的50％-90％；利用铺被基质胶的培养皿进行第n次传代后的铺板培养；在n次传代培养中，每一次传代培养时细胞长满至培养皿表面积的50％-90％；所述传代培养的具体操作为：第一次传代培养，利用铺被滋养层细胞的培养皿对待培养细胞进行培养，待长满至细胞培养板表面积的50％-90％时，去细胞培养上清，1×DPBS洗涤一次，加入胰酶消化，待大部分细胞变圆变亮后，将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液，用终止液终止消化，收集细胞悬液，离心去上清，并用培养基重悬细胞，最后将细胞铺于铺被滋养层细胞的培养皿上进行培养，隔天换液；第二次至第n-1次传代培养，待上一次传代培养细胞长满至培养皿表面积的50％-90％时，去培养上清，加入1×DPBS洗涤一次，加入胰酶消化，待大部分细胞变圆变亮后，将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液，用终止液终止消化，收集细胞悬液，离心去上清，并用培养基重悬细胞，最后将细胞铺于铺被滋养层细胞的培养皿上进行培养，隔天换液；第n次传代培养，待上一次传代培养细胞长满至培养皿表面积的50％-90％时，去培养上清，加入1×DPBS洗涤一次，加入胰酶和1×DPBS，在37℃中放置1-2min，将滋养层细胞吹打下来，再用1×DPBS洗涤一次，加入胰酶消化，待大部分细胞变圆变亮后，将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液，用终止液终止消化，收集细胞悬液，离心去上清，并用培养基重悬细胞，最后将细胞铺于包被基质胶的培养皿上进行培养，隔天换液；培养基的配方为：225mLDMEM、225mLF12、20-70mLFBS、0.2-2mML-谷氨酰胺、1-14ngmL胰岛素、0.1-1ngmL表皮生长因子、5-30ugmL腺嘌呤、2-20ugmL氢化可的松。

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