申请/专利权人：吉尼松公司;法国国家卫生及研究医学协会

申请日：2017-10-27

公开（公告）日：2024-03-12

公开（公告）号：CN110337493B

主分类号：C12N15/113

分类号：C12N15/113;C12N9/22;C12N15/63;C12N15/90;A61P21/00

优先权：["20161028 EP 16306426.4"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.12#授权;2019.11.08#实质审查的生效;2019.10.15#公开

摘要：本发明涉及用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法。

主权项：1.一种sgRNA分子对，其中所述对包含能够通过碱基配对与靶基因组DNA序列的互补序列结合的第一sgRNA分子和第二sgRNA分子，所述第一sgRNA分子和第二sgRNA分子分别位于定位在DMPK基因的3'-非翻译区3'-UTR内的核苷酸重复序列扩张区的5'和3'，其中所述第一sgRNA分子能够在Cas9内切核酸酶的存在下在所述3'-UTR内诱导所述核苷酸重复序列扩张区的5'的双链断裂；其中所述第二sgRNA分子能够在Cas9内切核酸酶的存在下在所述3'-UTR内诱导所述核苷酸重复序列扩张区的3'的双链断裂；其中所述Cas9内切核酸酶源自于金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusSaCas9，或其中所述Cas9内切核酸酶是SaCas9的功能性变体；其中所述第二sgRNA分子包含20-25个核苷酸的向导序列，所述向导序列包含SEQIDNO：12中所示的核苷酸序列。

全文数据：用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法技术领域本发明涉及用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法。背景技术核苷酸重复序列扩张区nucleotiderepeatexpansion，尤其是三核苷酸重复序列扩张区，涉及超过二十余种神经和发育障碍。已经提出治疗这些疾病的一种方法是使用高度特异性的核酸酶将重复序列缩短至非病理性长度参见RichardGF的综述，TrendsGenet.2015年4月；314：177-186。高度特异性的核酸酶例如兆核酸酶meganuclease、ZFN、TALEN和CRISPR-Cas9核酸酶已用于这样的策略中。然而，本领域技术人员认为后者不适合用于切除三核苷酸重复序列扩张区参见上文引用的Richard。总之，TALEN被认为是更有前途的缩短三核苷酸重复序列的工具。针对这种强烈的偏见，本发明人在此表明可以实施CRISPR-Cas9系统以从DMPK基因中的基因组DNA切除核苷酸重复序列扩张区，从而提供用于治疗肌强直性营养不良的强大且意想不到的工具。更特别地，本发明人发现了如何使用源自于金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus的Cas9来改善DMPK基因内核苷酸重复序列扩张区的切除效率。发明内容本发明人已经表明，针对上文展现的强烈偏见，CRISPR-Cas9系统可以有效地用于切除核苷酸重复序列扩张区。本发明涉及使用源自于金黄色葡萄球菌S.aureus并具有适当的单个向导RNAsingleguideRNAsgRNA的CRISPR-Cas9系统来切除DMPK基因内核苷酸重复序列扩张区的改进工具。在一个方面，本文公开了可用于从DMPK基因的3'-UTR特异性切除核苷酸重复序列扩张区、尤其是三核苷酸重复序列扩张区的单个向导RNAsgRNA分子。本文公开的sgRNA分子能够通过碱基配对与所靶向的核苷酸扩张区的5'或3'的基因组DNA靶序列前间区序列的互补序列结合，并且能够将Cas9内切核酸酶募集至sgRNA和基因组DNA之间的杂交位点或附近。更确切地说，本文用于切除三核苷酸重复序列扩张区的Cas9内切核酸酶源自于金黄色葡萄球菌SaCas9。本发明的sgRNA分子包含适合于在所述互补位点附近诱导SaCas9介导的双链断裂的所有序列元件。特别地，本申请公开了适合于实现DMPK基因的3'-非翻译区3'-UTR中存在的核苷酸重复序列扩张区的切除的sgRNA对，其中所述sgRNA对包含第一sgRNA和第二sgRNA，所述第一sgRNA与位于所述核苷酸重复序列扩张区的5'的靶基因组DNA序列互补，并且所述第二sgRNA与位于所述核苷酸重复序列扩张区的3'的靶基因组DNA序列互补。所述第一sgRNA分子能够在Cas9内切核酸酶的存在下在DMPK基因的3'-UTR内诱导所述核苷酸重复序列扩张区的5'的双链断裂。所述第二sgRNA分子能够在Cas9内切核酸酶的存在下在DMPK基因的3'-UTR内诱导所述核苷酸重复序列扩张区的3'的双链断裂。在本发明的上下文中，所述Cas9内切核酸酶源自于金黄色葡萄球菌SaCas9，或所述Cas9内切核酸酶是SaCas9的功能性变体。所述第二sgRNA分子包含15-40个核苷酸的向导序列，所述向导序列包含SEQIDNO：12中所示的核苷酸序列。在一个特定实施方式中，所述第二sgRNA的向导序列由选自SEQIDNO：5、SEQIDNO：6和SEQIDNO：21的核苷酸序列组成。在一个特定实施方式中，所述第一sgRNA分子包含长度为15-40个核苷酸的向导序列，所述向导序列包含SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10或SEQIDNO：11中所示的核苷酸序列。本发明的另一个方面涉及一种sgRNA，其包含能够通过碱基配对与靶基因组DNA序列的互补序列结合的序列，所述靶基因组DNA序列位于DMPK基因的3'-UTR内的核苷酸重复序列扩张区的5'或3'；其中所述sgRNA分子能够在源自于金黄色葡萄球菌的Cas9内切核酸酶SaCas9或作为SaCas9的功能性变体的Cas9内切核酸酶存在下在所述3'-UTR内诱导所述核苷酸重复序列扩张区的5'或3'的双链断裂；其中所述sgRNA包含15-40个核苷酸的向导序列，所述向导序列包含选自SEQIDNO：8-12的序列。本文公开的另一个方面是所述CRISPR-Cas9系统在切除靶细胞基因组DNA内DMPK基因的3'UTR内的核苷酸重复序列扩张区中的用途。根据进一步的方面，本文公开了一种从细胞的基因组DNA中DMPK基因的3'-UTR切除核苷酸重复序列扩张区的方法，所述方法实施了所述CRISPR-Cas9系统。所述方法可以包括向细胞中引入如上所述的sgRNA分子对以及源自于金黄色葡萄球菌的Cas9内切核酸酶或源自于金黄色葡萄球菌的Cas9内切核酸酶的功能性变体的编码基因。在另一个方面，本文公开了一种用于治疗1型肌强直性营养不良的方法，其中至少使用如上所述的sgRNA分子对和源自于金黄色葡萄球菌的Cas9内切核酸酶或源自于金黄色葡萄球菌的Cas9内切核酸酶的功能性变体从DMPK基因切除核苷酸重复序列扩张区。在一个特定实施方式中，被切除的核苷酸重复序列扩张区是位于DMPK基因的3'-UTR内的双、三、四、五或六核苷酸重复序列扩张区，优选三核苷酸重复序列扩张区。在一个特定实施方式中，所述核苷酸重复序列扩张区可包含20个或更多的重复序列，例如20至10000个重复序列，特别是50至5000个重复序列。更具体地，本发明的用途和方法可包括向细胞例如有需要的对象的细胞中引入：i第一sgRNA分子；ii长度为15-40个核苷酸的第二sgRNA分子，其包含SEQIDNO：12中所示的序列；和iii源自于金黄色葡萄球菌的CRISPRCas9内切核酸酶、或源自于金黄色葡萄球菌的CRISPRCas9内切核酸酶的功能性变体；其中所述第一和第二sgRNA分别与位于DMPK基因的3'-UTR内的核苷酸重复序列扩张区的5'和3'的序列互补，从而适合于通过在DMPK基因的所述3'-UTR内诱导所述核苷酸重复序列扩张区的5'的双链断裂、以及在DMPK基因的所述3'-UTR内诱导所述核苷酸重复序列扩张区的3'的双链断裂来切除所述核苷酸重复序列扩张区。本发明提供了一种用于治疗1型肌强直性营养不良DM1的治疗策略。所述sgRNA分子被设计成通过碱基配对与DMPK基因的3'-UTR中的基因组DNA靶序列或称为靶序列的互补序列结合。该靶序列称为前间区序列protospacer，并位于称为PAM前间区序列邻近基序Protospaceradjacentmotif的核苷酸基序旁边，PAM被所实施的源自于金黄色葡萄球菌的Cas9内切核酸酶SaCas9特异性识别。换句话说，所述sgRNA分子包含与所述前间区序列相对应的向导RNA序列，以便与所述前间区序列的互补序列结合。在一些实施方式中，所述sgRNA分子包含向导RNA序列和支架序列，其中所述向导RNA序列具有15至40个核苷酸，特别是17至30个核苷酸，特别是20至25个核苷酸，例如20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一个特定实施方式中，所述向导RNA序列具有21至24个核苷酸。在一个特定实施方式中，所述sgRNA分子包含由21或24个核苷酸组成的向导RNA序列。另一个方面涉及编码如本文提供的sgRNA或sgRNA分子对的载体，所述载体优选是质粒或病毒载体，例如rAAV载体或慢病毒载体，特别是rAAV载体。在一些实施方式中，所述SaCas9内切核酸酶和或所述sgRNA分子由一种或几种载体例如一种或几种质粒或病毒载体表达。例如，所述SaCas9内切核酸酶可以由第一载体表达，而所述第一和第二sgRNA分子可以由单一的第二载体表达，或者一个由第二载体表达而另一个由第三载体表达。在另一个实施方式中，实施所述CRISPR-Cas9系统所必需的所有元件都被包含在单一载体中。在另一个实施方式中，SaCas9内切核酸酶和sgRNA分子在体外预组装为核糖核蛋白复合物RNP，然后通过转染方法递送给细胞。在进一步的实施方式中，纯化的重组SaCas9内切核酸酶蛋白和sgRNA分子在体外合成并分开地递送给细胞。在另一个实施方式中，如上所述的sgRNA分子对与另一种sgRNA分子对组合使用。在这个实施方式中，组合使用的sgRNA分子对可以由一种或几种载体例如一种或几种质粒或病毒载体表达。另一个方面涉及靶细胞，其用如本文所述的载体转染或转导。在进一步的方面，本文公开了一种试剂盒，其包含SaCas9内切核酸酶、或SaCas9内切核酸酶的功能性变体，以及如上所述的第一和第二sgRNA分子。在另一个方面，本文公开了一种试剂盒，其包含编码SaCas9内切核酸酶的载体和编码如上所述的第一和或第二sgRNA分子的载体，或表达所述SaCas9内切核酸酶和一种或两种sgRNA分子的单一载体。如上所述，试剂盒中的载体可以是质粒载体或病毒载体。在进一步的方面，本文公开了一种试剂盒，其包含SaCas9内切核酸酶和sgRNA分子的核糖核蛋白复合物。在另一个方面，本文公开了一种试剂盒，其包含在体外分开地合成的重组SaCas9内切核酸酶蛋白和sgRNA分子。另外，本发明的试剂盒可以包括任何其它试剂例如缓冲剂和或一种或多种转染试剂或可用于实施本文公开的方法和用途的装置。本发明的其它方面和实施方式将在以下详细描述中显而易见。附图说明图1.SaCas9和SasgRNA表达盒。addgene质粒61591及其衍生质粒MLS43含有较小的启动子EFS而不是原始CMV和MLS47含有用于表达第二sgRNA的第二盒中来自金黄色葡萄球菌的Cas9SaCas9的表达盒。来自金黄色葡萄球菌的Cas9的序列是具有以下GenBankID：CCK74173.1的序列，Addgene质粒61591。图2.选择的sgRNA前间区序列，相应的基因组靶标和PAM，以及切割效率。与sgRNA的向导序列对应的sgRNA前间区序列靶向从基因DMPK的终止密码子到polyA信号在CTG重复序列的上游或下游的基因组区域。示出了SaCas9特异性的相应基因组靶序列和PAM前间区序列邻近基序。测试了所有sgRNA在它们的基因组靶标处切割DNA的能力。通过在线程序TIDE分析的切割效率的结果显示在表的最后一列中。图3.从DMPK基因的终止密码子此处任意指示为核苷酸1到polyA在DMPK3'-UTR的CTG重复序列周围的基因组区域。指示了在DMPK3'-UTR内测试的所有sgRNA的位置。SaCas9特异性的相应PAM前间区序列邻近基序由长方形围绕。CTG重复序列、以及DMPK终止密码子和polyA信号加下划线。图4.在HeLa细胞A和DM1人细胞iPS来源的MPCB中DMPKCTG重复序列的删除。DMPK3’-UTR区域是从所指示的细胞系中提取的gDNA中PCR扩增的，并在1.5％琼脂糖凝胶中分离PCR产物。用含有所指示的sgRNA对的质粒MLS43的衍生物转染细胞。将下游sgRNA12B和12与上游sgRNA1、4、7和8B中的每一个一起进行测试。来自仅用SaCas9表达质粒或GFP表达质粒转染的细胞的gDNA用作对照ctrl。经删除的PCR片段的预期大小在琼脂糖凝胶图片下方的图块中指示。图5.对带有DMPKCTG重复序列删除的基因组区域的测序检查。从琼脂糖凝胶中提取对应于含有CTG重复序列删除的那些图4中由箭头指示的PCR产物，纯化并通过标准测序进行测序。未经删除的基因组区域WT与经删除的区域Δ后接的是sgRNA对的相应编号之间的比对显示了SaCas9的准确位置即前间区序列的核苷酸N3和N4之间。图6.用慢病毒载体CRISPR-Cas9处理的DM1细胞中DMPKCTG重复序列的删除和聚集点消失。A分别处于CMV和U6启动子表达下的来自金黄色葡萄球菌Sa的慢病毒载体Cas9和sgRNA的双系统的示意图。UP和DW：靶向CTG重复序列上游和下游的基因组区域的sgRNA。B通过基因组PCR检测DM1永生化成肌细胞中的CTG重复序列切除。将来自带有2600个CTG重复序列的患者的细胞用MOI递增的慢病毒载体Cas9和sgRNA4-12和8B-12对，如各琼脂糖凝胶图像的左侧所示转导。编辑和未编辑的PCR扩增子分别由黑色和白色箭头指示。CTG重复序列删除百分比的估算在对应的PCR条带下方指示#％DEL。C在用慢病毒载体CRISPR-Cas9处理后已经失去细胞核聚集点的DM1细胞的定量。图7.通过AAV-CRISPR在杂合DMSXL小鼠中体内删除DMPKCTG重复序列扩张区。A分别处于SPc5-12和U6启动子表达下的SaCas9和sgRNA的AAV。eGFP-K＝与Kash肽连接的增强型GFP蛋白以处理进入核膜的蛋白。B和C显示了经受AAV载体Cas9和sgRNA的肌内注射的小鼠中的CTG重复序列切除的基因组PCR。将数量相等的AAVCas9和sgRNA病毒粒子共注射到左侧胫骨前肌中+，并测试了两个剂量：～1*10^11B和2*10^11C总Vg。-：阴性对照，用PBS注射右侧胫骨前肌。黑色箭头：具有CTG删除的PCR产物794bp。星号：小于预期大小4200bp的未经删除的PCR产物。具体实施方式发明人在本文中表明，源自于金黄色葡萄球菌的CRISPR-Cas9系统可以有效地用于从DMPK基因切除核苷酸重复序列，从而提供用于治疗1型肌强直性营养不良DM1的有力工具。因此，在第一个方面，本文公开了i第一sgRNA分子，其能够通过碱基配对与基因组DNA中的靶序列前间区序列的互补序列结合，所述靶序列位于定位在DMPK基因的3'UTR内的核苷酸重复序列的5'。ii第二sgRNA分子，其能够通过碱基配对与基因组DNA中的靶序列前间区序列的互补序列结合，所述靶序列位于定位在DMPK基因的3'UTR内的核苷酸重复序列的3'。iiisgRNA分子对，所述sgRNA分子各自能够通过碱基配对与基因组DNA中的靶序列的互补序列结合，所述靶序列分别位于定位在DMPK基因的3'UTR内的核苷酸重复序列的5'和3’。CRISPR-Cas9系统II型成簇规律性间隔短回文重复序列ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeatsCRISPR系统是一种RNA引导的内切核酸酶技术，最近已表现为一种有前途的基因组编辑工具。该系统有两个不同的组分：1向导RNA和2内切核酸酶，在这种情况下是CRISPR相关Cas核酸酶，Cas9。向导RNA是细菌CRISPRRNAcrRNA和反式激活crRNAtracrRNA的组合，其被工程化为单个嵌合向导RNAsgRNA转录物Jinek等人，Science2012Aug7；3376096：816-21。sgRNA将crRNA的靶向特异性与tracrRNA的支架特性组合在单个转录物中。当sgRNA和Cas9在细胞中表达时，可以修饰或永久性破坏基因组靶序列。所述sgRNACas9复合物通过sgRNA向导序列与基因组DNA中靶序列前间区序列的互补序列之间的碱基配对而被募集到靶序列。为了成功结合Cas9，所述基因组靶序列也必须含有紧跟在所述靶序列之后的正确的前间区序列邻近基序PAM序列。所述sgRNACas9复合物的结合将Cas9定位于所述基因组靶序列，使得所述Cas9内切核酸酶可以切割DNA的两条链，导致双链断裂DSB。Cas9将在PAM序列上游的第3和第4个核苷酸之间切割。根据在本发明中实施的系统，然后可以通过非同源末端连接NHEJ修复途径来修复所述DSB。本发明涉及这种功能强大的系统的实施，所述系统在本文中以创新的方式得到改进，用于有效地切除已报道与1型肌强直性营养不良DM1相关的重复序列。Cas9内切核酸酶II型CRISPR-Cas系统的DNA靶向机制涉及向导RNA，所述向导RNA指导Cas9内切核酸酶以序列特异性方式切割所靶向的DNA，这取决于所靶向的DNA上前间区序列邻近基序PAM的存在。PAM序列取决于Cas9内切核酸酶所源于的细菌物种而异。在本发明的上下文中，Cas9内切核酸酶源自于金黄色葡萄球菌SaCas9。因此，DNA的切割取决于SaCas9特异性的PAM的存在。SaCas9的共有PAM序列是NNGRRT，其中R＝A或G互补链中为AYYCNN，其中Y＝T或CRanFA等人，Nature2015；KleinstiverBP等人，NatBiotech2015。本发明中使用的Cas9内切核酸酶也可以是SaCas9内切核酸酶功能性变体。“功能性变体”是指变体Cas9内切核酸酶，其具有与亲本SaCas9内切核酸酶不同的序列，能够通过识别与亲本SaCas9相同的前间区序列邻近基序PAM并与sgRNA的相同恒定部分匹配来诱导DNA中的定点双链断裂。所述变体可以来源于亲本SaCas9内切核酸酶，例如具有GenBankIDCCK74173.1或由Addgene质粒61591编码的SaCas9具有如SEQIDNO：47中所示的氨基酸序列。例如，功能性变体SaCas9内切核酸酶与已知的SaCas9内切核酸酶相比可包含一个或多个氨基酸插入、缺失或取代，并且可以与已知的SaCas9内切核酸酶具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。向导RNA本文公开了单个向导RNA或sgRNA，其被具体设计成使用源自于金黄色葡萄球菌的Cas9内切核酸酶或源自于金黄色葡萄球菌的Cas9内切核酸酶的变体从DMPK切除三核苷酸重复序列扩张区。如上所述，所述sgRNA是所述CRISPR-Cas9系统中为所述系统提供基因组DNA靶向特异性的部分。被靶向的基因组DNA序列包含15至40个核苷酸，特别是20至30个核苷酸，特别是20至25个核苷酸，例如20、21、22、23、24、25个核苷酸，其后面是如上所述的适当的前间区序列邻近基序PAM。在一个特定实施方式中，所述sgRNA分子包含向导RNA序列，其与在DMPK基因的3'-UTR内的PAM之前的15至40个核苷酸、特别是20至30个核苷酸、特别是20至25个核苷酸、例如20、21、22、23、24、25个核苷酸、更具体是21或24个核苷酸的基因组序列的互补序列互补。在一个特定实施方式中，所述向导RNA序列与DMPK的所述基因组序列相同或具有至少80％同一性，优选至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或至少99％同一性并且能够与SaCas9特异性的PAM之前的15至40个核苷酸、特别是20至30个核苷酸、特别是20至25个核苷酸、例如20、21、22、23、24、25个核苷酸、更具体是21或24个核苷酸的所述基因组序列的互补序列杂交。如本领域技术人员公知的，sgRNA不含PAM基序，因此不与PAM的互补序列结合。靶序列可以位于DMPK基因的3'-UTR内的所述基因组DNA的任一条链上。因此，根据本发明，整个靶序列和PAM均在DMPK基因的3'-UTR中。在本发明的上下文中，“3'-UTR”被定义为从DMPK基因的终止密码子到DMPK基因的多腺苷酸化的基因组区域。生物信息学工具可用于鉴定包含适当的PAM的靶基因组DNA序列，例如由以下网络工具提供的那些：CRISPRDesignhttp:crispr.mit.edu，E-CRISPhttp:www.e-crisp.orgE-CRISPdesigncrispr.html，CasFinderhttp:arep.med.harvard.eduCasFinder，和CRISPORhttp:tefor.netcrisporcrispor.cgi。本领域技术人员也可以参考Doench等人，NatBiotechnol.2014年12月；3212：1262-7或Prykhozhij等人，PLoSOne.2015年3月5日；103：e0119372，并且可以在以下网站http:www.cnb.csic.es～montoliuCRISPR上找到关于CRISPR-Cas9系统以及鉴定包含适当PAM的靶基因组DNA的其它信息和资源。或者，可以通过在序列比对工具例如BLAST或FASTA算法中使用PAM序列作为查询，在目标基因内鉴定这样的PAM序列。然而，在本申请中，发明人表明在靶向DMPK基因中所述核苷酸重复序列的下游区域的那些sgRNA中，仅有数量有限的sgRNA能够提供这种重复序列的有效切除。众所周知，sgRNA是crRNA和tracrRNA的融合体，其提供靶向特异性这是由向导序列与靶基因组DNA序列的互补序列的碱基配对所赋予的和对Cas9内切核酸酶的支架结合能力两者。换句话说，sgRNA分子包括向导序列对应于crRNA的与前间区序列的互补序列结合的特异性部分和sgRNA恒定部分包含crRNA的非特异性部分、接头环和tracrRNA。在两者都源自于金黄色葡萄球菌的意义上，所述sgRNA恒定部分和所选择的Cas9内切核酸酶匹配。在一个特定实施方式中，所述sgRNA的恒定序列是如SEQIDNO：7所示的SasgRNA恒定部分81个核苷酸的序列，源自于Addgene质粒61591。SEQIDNO：7：GUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUU在另一个实施方式中，所述sgRNA的恒定序列是SEQIDNO：7中所示的SasgRNA恒定部分的功能性变体，其与SEQIDNO：7中所示的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性并且能够提供对于SaCas9内切核酸酶或对于SaCas9内切核酸酶的功能性变体的支架结合能力。分子生物学试剂盒和工具，例如适当的质粒，可用于容易地产生在DMPK的被靶向的基因组DNA序列和SaCas9内切核酸酶这两个方面具有期望特异性的sgRNA。例如，许多质粒和工具可得自Addgene。在一个特定实施方式中，所述sgRNA或sgRNA对在U6启动子控制下由质粒表达。在一个特定实施方式中，本发明的sgRNA对的两个sgRNA由在同一载体中例如在同一质粒中，或在同一重组病毒基因组例如AAV基因组或慢病毒基因组中含有所述两个sgRNA支架的单个表达盒表达，每个支架在启动子、特别是U6启动子的控制下。在一个特定实施方式中，所述两个sgRNA支架以反向位置或尾对尾取向或以串联提供，特别是以串联例如头对尾取向提供。在另一个实施方式中，SaCas9内切核酸酶编码基因可操作地连接于启动子，例如诱导型或组成型启动子，特别是遍在性或组织特异性启动子，特别是肌肉特异性启动子。遍在性启动子包括例如EFS、CMV、SFFV或CAG启动子。肌肉特异性启动子包括但不限于本领域公知的肌肉肌酸激酶MCK启动子、desmin启动子或合成的C5.12启动子。另外，用于表达SaCas9内切核酸酶的启动子可以是诱导型启动子，例如四环素、他莫昔芬或蜕皮素诱导型启动子。所述第一和第二sgRNA分子各自与分别在待切除的DMPK的核苷酸重复序列扩张区的5'和3'的区域互补。所述sgRNA分子因此被设计成特异性结合具有PAM的核苷酸重复序列扩张区的上游和下游区域，其中整个靶序列和PAM在DMPK基因的3'UTR内。所述被靶向序列同源区域+PAM与被切除区域的距离可能不是关键的，但为了使基因结构的不稳定性最小化，所述被靶向序列可以被选择成距离所述核苷酸重复序列扩张区的最接近末端在小于500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20或小于10个核苷酸之内。例如，考虑到所述sgRNA被设计成引导诱发所述核苷酸重复序列扩张区的5'的DSB，被靶向序列的PAM的最3'核苷酸距离待切除的核苷酸重复序列扩张区的第一考虑5'至3'方向核苷酸的最5'核苷酸在小于500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20或小于10个核苷酸之内。所述sgRNA分子被设计成使用SaCas9切除位于DMPK基因的3'非翻译区内的三核苷酸重复序列扩张区。在该实施方式的特定变体中，本发明涉及包含15-40个核苷酸的向导序列的sgRNA分子，所述向导序列包含选自以下的序列：AGUCGAAGACAGUUCSEQIDNO：8ACAACCGCUCCGAGCSEQIDNO：9GGCGAACGGGGCUCGSEQIDNO：10AGGGUCCUUGUAGCCSEQIDNO：11GAACCAACGAUAGGUSEQIDNO：12。在一个更特定的实施方式中，本发明涉及包含选自以下的向导序列的sgRNA分子：GCCCCGGAGUCGAAGACAGUUCSEQIDNO：1CAGUUCACAACCGCUCCGAGCSEQIDNO：2GCGGCCGGCGAACGGGGCUCGSEQIDNO：3GGCUCGAAGGGUCCUUGUAGCCSEQIDNO：4CUUUGCGAACCAACGAUAGGUSEQIDNO：5GCACUUUGCGAACCAACGAUAGGUSEQIDNO：6在一个更特定的实施方式中，本发明涉及包含选自以下的向导序列的sgRNA分子GCCCCGGAGUCGAAGACAGUUCSEQIDNO：1GCAGUUCACAACCGCUCCGAGCSEQIDNO：20GCGGCCGGCGAACGGGGCUCGSEQIDNO：3GGCUCGAAGGGUCCUUGUAGCCSEQIDNO：4GCUUUGCGAACCAACGAUAGGUSEQIDNO：21GCACUUUGCGAACCAACGAUAGGUSEQIDNO：6。在如上所示的SEQIDNO：20和21中，因为需要G来开始U6启动子的转录，所以与SEQIDNO：2和5相比分别引入了加下划线的G碱基。然而，本领域技术人员将会理解，其它启动子在紧接在所述向导编码序列之前的这个位置可能不需要G，或者如本领域公知的，可能需要一种或多种其它核苷酸碱基。本发明还涉及如上定义的载体，其包含编码sgRNA分子的序列，所述sgRNA分子包含选自SEQIDNO：1至6、SEQIDNO：20和SEQIDNO：21的向导序列。在进一步的特定实施方式中，编码sgRNA分子的序列还包含编码如SEQIDNO：7中所示的sgRNA恒定部分序列、或如上定义的其功能性变体的序列。更特别地，编码整个sgRNA分子的序列选自SEQIDNO：13至18。在一个特定实施方式中，所述sgRNA分子对是包含以下的sgRNA对：-第一sgRNA分子，用于诱导位于DMPK基因的3'UTR内的三核苷酸重复序列扩张区的上游或5'的双链断裂DSB，其中所述上游DSB在所述3'-UTR内诱导；-第二sgRNA分子，用于诱导DMPK的三核苷酸重复序列扩张区的下游或3'的DSB，其中所述下游DSB在所述3'-UTR内诱导，其中所述第二sgRNA分子包含向导序列，所述向导序列的长度为15-40个核苷酸、特别是20至30个核苷酸、特别是20至25个核苷酸，例如由20、21、22、23、24或25个核苷酸、特别是21或24个核苷酸组成，并包含SEQIDNO：12中所示的序列。在一个更特定的实施方式中，所述第一sgRNA分子包含向导序列，所述向导序列的长度为15-40个核苷酸、特别是20至30个核苷酸、特别是20至25个核苷酸、例如由20、21、22、23、24或25个核苷酸、特别是21或24个核苷酸组成，并包含选自SEQIDNO：8至SEQIDNO：11的序列。在一个优选实施方式中，所述第一sgRNA的向导序列由选自SEQIDNO：1至SEQIDNO：4和SEQIDNO：20的核苷酸序列组成。在另一个优选实施方式中，所述第二sgRNA的向导序列由选自SEQIDNO：5、SEQIDNO：6和SEQIDNO：21的核苷酸序列组成。在另一个实施方式中，本发明的sgRNA分子对包含选自以下的向导序列对：-SEQIDNO：1和SEQIDNO：5或SEQIDNO：21；-SEQIDNO：2和SEQIDNO：5或SEQIDNO：21；-SEQIDNO：20和SEQIDNO：5或SEQIDNO：21；-SEQIDNO：3和SEQIDNO：5或SEQIDNO：21；-SEQIDNO：4和SEQIDNO：5或SEQIDNO：21；-SEQIDNO：1和SEQIDNO：6；-SEQIDNO：2和SEQIDNO：6；-SEQIDNO：20和SEQIDNO：6；-SEQIDNO：3和SEQIDNO：6；和-SEQIDNO：4和SEQIDNO：6。如上所述，本发明的sgRNA可以从表达盒表达。所述sgRNA的表达可以特别地由启动子例如U6启动子控制。因此，本发明还包括sgRNA的表达盒，其包含置于启动子例如SEQIDNO：19中所示的U6启动子控制下的sgRNA编码序列。在一个特定实施方式中，所述表达盒包含以下序列用于从U6启动子表达sgRNA：-以5'至3'取向，SEQIDNO：19、SEQIDNO：48和SEQIDNO：54的组合；-以5'至3'取向，SEQIDNO：19、SEQIDNO：49和SEQIDNO：54的组合；-以5'至3'取向，SEQIDNO：19、SEQIDNO：50和SEQIDNO：54的组合；-以5'至3'取向，SEQIDNO：19、SEQIDNO：51和SEQIDNO：54的组合；-以5'至3'取向，SEQIDNO：19、SEQIDNO：52和SEQIDNO：54的组合；或-以5'至3'取向，SEQIDNO：19、SEQIDNO：53和SEQIDNO：54的组合。本发明的方法和用途本发明设想了用SaCas9内切核酸酶和sgRNA分子触及DMPK的靶基因组DNA序列的各种方式。在一些实施方式中，将所述SaCas9内切核酸酶以多肽形式引入细胞内。在一个变体中，所述SaCas9内切核酸酶与细胞穿透肽缀合或融合，所述细胞穿透肽是促进分子摄入到细胞中的肽。所述sgRNA分子也可以作为分离的寡核苷酸直接施用于细胞或使用转染试剂例如脂质衍生物、脂质体、磷酸钙、纳米粒子、显微注射或电穿孔施用于细胞。SaCas9内切核酸酶和sgRNA分子也可以在体外预组装为核糖核蛋白复合物，然后直接或使用转染试剂递送给细胞。在另一个实施方式中，本发明设想了将所述SaCas9内切核酸酶和或sgRNA分子以表达所述内切核酸酶和或sgRNA分子的载体的形式引入靶细胞。因此，本发明还涉及编码本发明的sgRNA分子或sgRNA分子对的载体。在细胞中引入和表达基因的方法是本领域已知的。可以通过物理、化学或生物手段将表达载体转移到宿主细胞中。可以使用已知的物理方法例如磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔将表达载体引入细胞中。用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散体系，例如大分子复合物、纳米囊、微球、珠子、以及脂质衍生物和脂质体。在其它实施方式中，通过生物手段、特别是通过病毒载体引入所述SaCas9内切核酸酶和或sgRNA分子。可用于本发明的实践中的代表性病毒载体包括但不限于，源自于腺病毒、逆转录病毒、特别是慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I和腺相关病毒AAV的载体。适当的病毒载体的选择当然将取决于靶细胞和病毒嗜性。在一个实施方式中，所述SaCas9内切核酸酶和sgRNA分子被提供在不同载体例如两种载体，一种含有编码SaCas9内切核酸酶的基因，第二种编码两种sgRNA分子；或三种载体，一种编码SaCas9内切核酸酶，以及每种sgRNA分子各一种载体内。在另一个实施方式中，从单一表达载体表达所述CRISPR-Cas9系统的所有元件，包括从DMPK切除三核苷酸重复序列扩张区所需的SaCas9内切核酸酶和两种sgRNA分子。在一个特定实施方式中，将本发明的SaCas9内切核酸酶和sgRNA分子与其它DM1处理组合，同时或顺序地使用。特别地，本发明的SaCas9内切核酸酶和sgRNA分子可以与另一种sgRNA分子对和另一种或相同的Cas9内切核酸酶组合，同时或顺序地使用，以切除所述重复序列扩张区。在一个特定实施方式中，所述另一种sgRNA分子对选自EP16306427其通过引用整体并入中公开的对。在一个特定实施方式中，所述另一种sgRNA分子对包含含有15-40个核苷酸的向导序列的sgRNA分子，所述向导序列包含EP16306427的SEQIDNO：11中所示的核苷酸序列。在另一个特定实施方式中，所述另一种sgRNA分子对包含第一sgRNA分子，其包含长度为15-40个核苷酸的向导序列，所述向导序列包含EP16306427的SEQIDNO：7、EP16306427的SEQIDNO：8、EP16306427的SEQIDNO：9或EP16306427的SEQIDNO：10中所示的核苷酸序列。在另一个特定实施方式中，所述另一种sgRNA分子对包含第一sgRNA分子，其中所述第一sgRNA的向导序列由选自EP16306427的SEQIDNO：1-4和EP16306427的SEQIDNO：18的核苷酸序列组成。在另一个特定实施方式中，所述另一种sgRNA分子对包含第二sgRNA分子，其中所述第二sgRNA分子的向导序列由EP16306427的SEQIDNO：5中所示的核苷酸序列组成。在一个方面，本发明还涉及包含本发明的sgRNA分子或本发明的sgRNA对的靶细胞，或者用本发明的载体转染或转导的靶细胞。任选地，所述靶细胞还表达SaCas9内切核酸酶，例如从与表达本发明的sgRNA分子或sgRNA对的载体相同的载体表达SaCas9内切核酸酶。例如，重组细胞可选自iPS来源的间充质祖细胞MPC或hESC来源的MPC。本发明的系统用于在DMPK基因的3'非翻译区内切除核苷酸重复序列扩张区，特别是三核苷酸重复序列。在一个特定实施方式中，所述核苷酸重复序列扩张区例如三核苷酸重复序列扩张区包含所述核苷酸基序的20至10000个重复序列，更特别是50至5000个重复序列。例如，待切除的核苷酸重复序列扩张区例如三核苷酸重复序列扩张区可包含所述核苷酸基序的任何数量的重复序列，例如至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或至少超过2000个重复序列。更具体地，重复序列的数量是病理性的重复序列数量，这意味着所述核苷酸重复序列例如三核苷酸重复序列与疾病状态相关或可能相关。在一个特定实施方式中，所述重复序列是DMPK基因的3'非翻译区内的CTG重复序列，并且从20个以上重复序列或从50个以上重复序列起是病理性的。在一个特定实施方式中，所述核苷酸重复序列扩张区包含20至10000个重复序列，更特别是50至5000个重复序列。特别地，所述核苷酸重复序列扩张区包含1000至3000个重复序列，更特别是1200至2600个重复序列。用于本文中时，术语“治疗”和“医治”是指向对象施用有效量的组合物，使得所述对象具有至少一种疾病症状的减轻或疾病的改善，例如，有益或期望的临床结果。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于，减轻一种或多种症状、削弱疾病程度、稳定即，不加重疾病状态、延迟或减缓疾病进展、缓解或缓和疾病状态、以及消退无论是部分还是全部，无论是可检测的还是不可检测的。治疗可以指与如果不接受治疗时的预期生存相比延长生存。或者，如果疾病的进展降低或停止，则治疗是“有效的”。“医治”也可以意指与如果不接受治疗时的预期生存相比延长生存。需要治疗的那些包括已经诊断患有与多核苷酸序列表达相关的病症的那些，以及由于遗传易感性或其它因素可能发展这样的病症的那些。用于本文中时，术语“治疗”和“医治”还指预防疾病或病症，这意味着延迟或防止这样的疾病或病症的发作。本发明提供了核苷酸重复序列扩张区病症的治疗，所述病症是与DMPK基因的3'-非翻译区内的三核苷酸例如CTG重复序列扩张区相关的DM1。本发明还涉及如上所述的sgRNA分子对，其用作药物。本发明还涉及如上所述的sgRNA分子对，其用于治疗DM1的方法中。本发明还涉及如上所述的sgRNA分子对在制造用于治疗DM1的药物中的用途。本发明还涉及一种治疗DM1的方法，所述方法包括向有需要的对象施用有效量的如上所述的sgRNA分子对。可以配制和施用本发明的sgRNA分子、sgRNA分子对、重组SaCas9内切核酸酶蛋白、载体编码一种或多种sgRNA分子和或SaCas9内切核酸酶和细胞，以通过产生所述sgRNA分子、sgRNA分子对、载体和细胞与其在有需要的对象中的作用位点接触的任何手段来治疗肌强直性营养不良。本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的sgRNA或sgRNA对、或本发明的重组SaCas9内切核酸酶蛋白或载体单独或与SaCas9内切核酸酶编码序列一起，编码本发明的sgRNA、或sgRNA对、或本发明的细胞。这样的组合物包含治疗有效量的治疗剂本发明的sgRNA、载体或细胞和可药用载体。在一个具体实施方式中，术语“可药用”意指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国或欧洲药典或其它公认的药典中列出用于动物和人类。术语“载体”是指治疗剂与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或介质。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当所述药物组合物静脉内施用时，水是优选的载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射的溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物也可含有少量的润湿或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。口服制剂可以包含标准载体，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于E.W.MMartin的“雷明顿药物科学Remington'sPharmaceuticalSciences”中。这样的组合物将含有治疗有效量的所述治疗剂，优选为纯化的形式，以及适量的载体，以便提供恰当施用于对象的形式。所述药物组合物适于对哺乳动物、特别是人类的任何类型的施用，并按照例行程序配制。所述组合物通过使用合适的常规药物载体、稀释剂和或赋形剂来配制。所述组合物的施用可以经由任何常见途径，只要经由该途径可利用靶组织即可。这包括例如口服、鼻、皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内施用。优选地，将所述组合物配制成适于静脉内施用于人类的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，所述组合物也可以包含增溶剂和局部麻醉剂例如利诺卡因以缓解注射部位的疼痛。在治疗核苷酸重复序列扩张区中有效的本发明治疗剂的量可以通过标准临床技术来确定。此外，可任选地采用体内和或体外测定来帮助预测最佳剂量范围。制剂中采用的精确剂量也将取决于施用途径、疾病严重度，并应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。向有需要的对象施用的sgRNA、载体或细胞的剂量将基于若干因素而变化，所述因素包括但不限于施用途径、对象年龄、或获得所需治疗效果必需的表达水平。本领域技术人员可以基于该领域中的知识，基于这些因素和其它因素而容易地确定所需的剂量范围。实施例下面提供了将SEQIDNO与下面实验部分和图中使用的sgRNA编号匹配的表格。sgRNA编号1478B1212BSEQIDNO12034216材料和方法质粒构建编码金黄色葡萄球菌Cas9的质粒源自于质粒pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA；U6::BsaI-sgRNAMLS42[Ran等人，2015]。EFS启动子是用引物F-XhoI-MreI-EFSMLS63和R-XmaI-NruI-EFSMLS64PCR扩增的，并被克隆到无启动子的pX601-AAV-::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA；U6::BsaI-sgRNA的XhoIAgeI位点，以获得pAAV-EFS::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA；U6::BsaI-sgRNAMLS43。将第二个sgRNA盒U6::BbsI-sgRNA串联克隆到质粒MLS43中第一个sgRNA盒上游的Acc65I位点，以获得构建体pAAV-EFS::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA；U6::BbsI-sgRNA；U6::BsaI-sgRNAMLS47。使用现有盒U6::BsaI-sgRNA的相同序列但将sgRNA前间区序列克隆位点更换成BbsI，通过合成来合成GeneCust插入物U6::BbsI-sgRNA。具有nID编号的SasgRNA前间区序列，已经合成为正向和反向的寡核苷酸对表2并体外退火，然后将它们克隆到限制性位点BbsIMLS47衍生质粒pAAV-EFS::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA；U6::n-DMPK-sgRNA；U6::BsaI-sgRNA和BsaI质粒pAAV-EFS::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA；U6::n-sgRNA；U6::n-sgRNA_DMPK。通过使用pCCL质粒[pCC-hPGK.GFPMLS87；来自MarioAmendola博士的慷慨赠与]的骨架来构建慢病毒载体。将插入物U6::4-sgRNA；U6::12-sgRNA_DMPK和U6::8B-sgRNA；U6::12-sgRNA_DMPK源自于酶消化的质粒MLS83和MLS85克隆到质粒MLS87的XhoIEcoRV位点，以获得pCCL-U6::4-sgRNA；U6::12-sgRNA_DMPK-hPGK.GFP和pCCL-U6::8B-sgRNA；U6::12-sgRNA_DMPK-hPGK.GFPMLS99和MLS101。将源自于质粒MLS42的CMV启动子克隆到无启动子的pCCL-GFP没有hPGK启动子的MLS87的XhoIAgeI位点而获得pCCL-CMV-GFPMLS107。慢病毒载体pCCL-CMV-SaCas9MLS110的构建是通过将SaCas9PCR插入物[引物F-AgeI-SaCas9MLS142和R-SalI-SaCas9MLS143；质粒MLS42作为模板]克隆到pCCL-CMV没有GFP的MLS107的SalIAgeI位点来完成的。用于SaCas9和sgRNA对8B-12的腺相关病毒AAV载体已通过使用具有已测序的ITR的pAAV质粒[Genethon质粒库]构建。用引物F-PmeI-SaCas9MLS146和R-NotI-SaCas9_3xHEMLS147并使用质粒MLS42作为模板来PCR扩增SaCas9。将凝胶纯化的插入物SaCas9克隆到AAV质粒pC512-Int-smSVpolyAMLS1的PmeINotI位点中，从而获得pAAV-SPc5-12-SaCas9MLS118。pAAV-Des-eGFP-KASH-U6::8B-12-sgRNA_DMPKMLS122是通过将PCR插入物U6::8B-12-sgRNA_DMPK[引物F-MCS-前-U6SasgRNAMLS163和R-PmlI-EndSasgRNA-upMLS166；质粒MLS85作为模板]克隆到pAAV-Des-EGFP-KASHMLS23MLS27的AflIIMssI位点中而获得的。表1.质粒列表表2.引物列表sgRNA的设计手工以及通过程序CasBLASTRhttp:www.casblastr.org和CRISPORhttp:tefor.netcrispor筛选DMPK3’-UTR内所有可能的SaCas9靶标。PAM序列NNGRRT用于筛选，其中R＝A或G非编码链中为AYYCNN，其中Y＝T或C[Ran等人，Nature2015；Kleinstiver等人，NatBiotech2015]。对于每个sgRNA前间区序列，通过程序CasOFFinderhttp:www.rgenome.netcas-offinder，基于人类基因组“智人GRCh38hg38-人类2014年4月2日更新HomosapiensGRCh38hg38-Human02April2014Updated”并设置截止错配数≤4来计算潜在脱靶数。潜在脱靶也已通过CRISPORhttp:tefor.netcrispor基于人类基因组“智人-人类-UCSC2013年12月GRCh38hg38Homosapiens-Human-UCSCDec.2013GRCh38hg38”进行了检查。sgRNA前间区序列的选择通过将相应的潜在脱靶数和它们在DMPK3’-UTR区域内的靶位置考虑在内来进行。每个SasgRNA的长度从21到24不等。每当所述前间区序列不以G开始时，就将该核苷酸添加到所述序列的5'以优化U6驱动的转录。细胞培养HeLa细胞在具有高葡萄糖和GlutaMAXInvitrogen并补充有10％胎牛血清FBS，Invitrogen的Dulbecco改良Eagle培养基DMEM中培养。DM1细胞iPS来源的MPC在补充有20％FBS、1％MEM非必需氨基酸溶液ThermoFisherScientific和1％GlutaMAXTMSupplementThermoFisherScientific的KnockOutDMEMThermoFisherScientific中生长。永生化WT和DM1成肌细胞在补充有15％FBS的骨骼肌细胞生长培养基Promocell中培养，或在与199培养基1:4比率；LifeTechnologies混合并补充有20％FBS、25μgml胎球蛋白、0.5ngmlbFGF、5ngmlEGF和0.2μgml地塞米松Sigma-Aldrich的DMEM中培养。在汇合的细胞中通过用分化培养基补充有5μgml胰岛素的DMEM替换生长培养基来诱导成肌细胞的分化。使用37℃标准温度和5％CO2来生长和维持培养中的细胞。转染实验在转染前一天将细胞接种在6或12孔板中，并在70-90％的汇合度下转染。使用转染试剂FuGENEHD3:1比率的FuGENE-DNA；Promega和lipofectamine3000ThermoFisherScientific分别转染HeLa细胞和DM1PS来源的MPC细胞。转染后2-3天通过离心收获细胞，并将细胞沉淀团保持在-80℃直至提取基因组DNA。慢病毒载体和转导实验如以前所述Cantore等人，2015，通过磷酸钙沉淀进行293T细胞的瞬时四质粒转染来产生慢病毒载体。通过对感染的HCT116细胞的基因组DNA进行定量PCRqPCR来确定载体滴度[载体基因组mlvgml]分别由GenethonVectorCore和QualityControlServices进行病毒产生和滴定。将DM1成肌细胞在转导前一天接种于12孔板中，并在70％的汇合度下进行感染。在转导前除去生长培养基并代之以最小体积400μl皿的转导培养基[骨骼肌基础培养基Promocell或DMEM，补充有10％FBS和4μgml聚凝胺]。将病毒直接添加到转导培养基中并将细胞温育5-6小时，然后添加完全生长培养基。在转导后第1天，将细胞转移到6孔板中并保持培养两代，然后1收集并冷冻它们以供gDNA提取，2将它们固定以供FISH免疫荧光分析。基因组DNA提取和基因组PCR用GeneJet基因组DNA纯化试剂盒ThermoScientific或用QIAmpDNAMicroandMini试剂盒QIAGEN根据制造商的说明书从HeLa细胞和DM1iPS来源的MPC细胞中提取基因组DNA。通过MagNAPure96系统与MagNAPureLC总核酸分离试剂盒Roche，从永生化DM1成肌细胞以及从小鼠肌肉中提取gDNA。使用高保真TaqDNA聚合酶Invitrogen来扩增DMPK3’-UTR。按照制造商方案制备补充有10％DMSO的PCR主混合物。使用150ng的gDNA作为模板以及在Cas9预期切割位点的上游和下游退火的引物表2进行PCR。PCR条件如下：95℃下2分钟，35x[95℃下30秒，52℃下30秒，72℃下30秒]；72℃下10分钟。使用更多的循环38和更长的延伸时间5分钟以扩增DMSXL小鼠肌肉中的长CTG重复序列扩张区。PCR产物通过在含有GelRedDNA染色的1.5-2％琼脂糖凝胶中电泳进行分离。在UV曝光下拍摄凝胶图像并调节亮度和对比度。通过凝胶提取Gel和PCRClean-up，MacherayNageland纯化PCR产物，并通过SangerDNA测序BeckmanCoulterGenomics进行测序。DM1成肌细胞的荧光原位杂交和免疫荧光如TanejaKL所述[TanejaKL，1998]并加以一些修改[DenisFurlinglaboratory，InstitutdeMiologie，巴黎]进行FISH实验。简而言之，将培养在腔室载玻片Corning中的细胞在磷酸盐缓冲盐水PBS中洗涤并在4％多聚甲醛PFA中固定。固定后，将细胞在PBS中洗涤并储存在4℃下70％乙醇中。将细胞在PBS中水合并在杂交缓冲液40％甲酰胺，2x盐水-柠檬酸钠SSC，0,2％BSA中与探针Cy3标记的2’OMeCAG7Sigma-Aldrich一起温育。杂交后，将显微镜载玻片洗涤数次，然后在PBS0.25％TritonX-100中使细胞膜透化。SaCas9通过针对位于所述蛋白的C末端的HA标签表位的抗体来检测。纯化的小鼠单克隆抗HA标签Covance在5％BSA中1400稀释下用作第一抗体，并在室温下温育1小时30分钟。山羊抗小鼠633第二抗体ThermoScientific在5％BSA中11000稀释下使用，并在室温下温育1小时。使用具有DAPISouthernBiotech的安装溶液来组装显微镜载玻片与盖玻片。用共聚焦显微镜LeicaDMi8获取显微镜图像，用LeicaApplicationSuiteX软件分析，并用AdobePhotoshop或用ImageJ软件处理。动物和AAV载体注射携带从DM1患者克隆的45kb人类基因组DNA的DMSXL小鼠90％C57BL6背景用于体内研究[Huguet等人，2012]。通过如Gomes-Pereira和合作者[Gomes-Pereira等人，2007]所述的PCR测定转基因状态。小鼠的笼养和处理根据法国动物保护委员会FrenchCouncilonanimalcare“实验动物护理和使用指南GuideforthecareandUseLaboratoryAnimals”：EEC86609理事会指令-2001-131号法令制定的准则进行。RAAV载体由GenethonVectorCore和QualityControlService如以前所述Ronzitti等人，2016来产生和滴定。对被氯胺酮甲苯噻嗪混合物麻醉的6周龄DMSXL小鼠进行肌内注射。将AAV病毒注射到左侧TA中并测试两种不同的剂量：1*10^11和2*10^11总VgTA；将PBS注射到右侧TA中作为对照。注射后4周，收集TA肌肉并在液氮中冷冻。结果SaCas9和sgRNA表达盒在该研究中研究的Cas9是来自金黄色葡萄球菌的Cas9SaCas9。因为SaCas9的尺寸小并可以装入腺相关病毒AAV载体中，该内切核酸酶特别令人感兴趣。所有含有SaCas9和SasgRNA支架的质粒均源自于质粒pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA；U6::BsaI-sgRNAFengZhangLab，Addegene编号#61591，图1。为了在同一载体中包含SaCas9和两个sgRNA盒，首先将原始CMV启动子用较小的EFS替换图1，MLS43。SaCas9的表达及其核定位通过Western印迹和利用针对HA表位的Ab的免疫荧光来验证数据未显示。接下来，添加所述sgRNA的第二盒，与已存在的那个相同，但具有所述sgRNA前间区序列的不同克隆位点图1，MLS47。SgRNA前间区序列的序列对应于sgRNA的向导序列列于图2中，它们靶向从基因DMPK的终止密码子到polyA信号在CTG重复序列的上游或下游的基因组区域。图3中指示了在DMPK3'-UTR内测试的所有sgRNA的位置。测试sgRNA在它们的基因组靶标处切割DNA的能力。简而言之，用带有SaCas9和只一个sgRNA克隆在BbsI位点的前间区序列的质粒转染HeLa细胞，并在转染后2-3天收集。将从那些转染细胞中提取的基因组DNA用作模板以PCR扩增每个sgRNA的基因组靶标周围的DMPK3'-UTR区域。PCR产物被送去测序，转染和未转染细胞的色谱图文件用于通过在线程序TIDEhttp:tide-calculator.nki.nl分析切割效率。TIDE分析的结果显示在图2的表的最后一列中。该表的最后一列显示了在所测试的sgRNA前间区序列之中切割效率不等。特别是，测试的所有上游前间区序列1，4，7，8B都非常有效，通过TIDE得到的切割百分比在42和47.4％之间。关于下游前间区序列，本发明人意外地发现它们中的一些能更有效地切割CTG重复序列下游的区域。特别是，六个下游前间区序列10，15B，22，17A，17B，和19的切割百分比弱，在1.1到7.9％范围内，而两个下游前间区序列12和12B对于切割DNA特别有效，切割百分比分别为32.5％和28.8％。这些结果表明，在DNA切割方面，所有sgRNA完全没有表现出相同的效率，并且出乎意料地，下游sgRNA12和12B能够特别有效地切割CTG重复序列扩张区下游的DNA。人DMPK基因中CTG重复序列的SaCas9介导删除然后，我们使用SaCas9与适当sgRNA的组合在病理性CTG扩张区存在下的人DMPK基因座中测试了所述CRISPR-Cas9系统的功效。为了删除CTG重复序列扩张区，我们制造了在同一质粒中带有SaCas9和两个sgRNA的构建体，两个sgRNA中的一个靶向CTG重复序列上游的区域并且另一个靶向CTG重复序列下游的区域分别克隆到质粒MLS47的BbsI和BsaI位点，参见图1。所述sgRNA对基于它们的单一切割效率来选择TIDE分析，图2。更确切地说，将上游sgRNA1、4、7和8B各自与相比下游sgRNA10、15B、17A、17B、19和22而言提供最高切割百分比的下游sgRNA12或12B一起进行测试。带有SaCas9和所指示的sgRNA对的质粒用于转染HeLa细胞或DM1细胞iPS来源的MPC，来自I-Stem，Evry。如材料和方法中所述对DMPK3’-UTR进行PCR扩增，并将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中分离图4。从琼脂糖凝胶中提取相对于全长产物和含有CTG重复序列删除的产物的条带，并通过测序验证。未经删除的野生型DMPK3'-UTR区域和经删除的该区域之间的退火显示在图5中，并突出显示了每个测试的sgRNA对的切割位点即前间区序列的核苷酸N3和N4之间。总之，这些结果表明所述SaCas9-sgRNA系统适合于从人DMPK基因的3'-UTR区域有效切除CTG重复序列。它还表明，下游sgRNA的选择是实现从DMPK基因的3'-UTR区域有效切除CTG重复序列的重要参数。总之，本发明人鉴定了当与源自于金黄色葡萄球菌的Cas9内切核酸酶一起使用时导致有效的单一切割效率的特异性sgRNA前间区序列。此外，他们证明，利用SaCas9内切核酸酶与适当的sgRNA的组合的CRISPR-Cas9系统适合且有效地从DMPK3’UTR切除CTG重复序列。DM1患者细胞系中CTG重复序列的CRISPR-Cas9介导删除为了测试CRISPR-Cas9在删除长CTG重复序列扩张区中的能力，我们采用来自带有2600个CTG重复序列的患者的永生化DM1细胞Arandel等人，2017。我们构建了用于SaCas9和sgRNA的慢病毒载体，因为已知这些病毒高效转导成肌细胞。图6A中描绘了慢病毒构建体的图示：SaCas9在CMV启动子的控制下，靶向CTG重复序列上游和下游区域UP和DW的两个sgRNA的对是串联的并且均在U6启动子的控制下。用MOI感染复数递增的Cas9和sgRNA慢病毒载体转导DM1细胞，并通过基因组PCR测试CTG删除图6B。如材料和方法部分中所述并使用引物对F1-DMPK-3UTR和R1-DMPK-3UTR进行PCR。来自未处理细胞--或仅用50MOI的sgRNA慢病毒载体-50转导的细胞的gDNA用作阴性对照。较低分子量的条带4-12对为587bp，8B-12对为698bp代表有CTG重复序列的基因组删除的PCR产物，没有区分扩张和未扩张的等位基因。较高分子量的条带代表具有未扩张的CTG重复序列870bp的未经删除的基因组区域的PCR产物。因为长度巨大，我们无法PCR扩增所述扩张的未经删除的CTG重复序列2600个重复序列对应于长于8600bp的PCR产物。我们的结果显示，接种的病毒粒子的量与PCR条带的强度之间存在相关性：在载体的MOI递增时，我们可以观察到相对于CTG删除的条带的强度增加和相对于未经删除的PCR产物的条带的强度降低。这些数据显示Cas9和所选择的sgRNA对4-12和8B-12在DM1成肌细胞中被慢病毒载体有效递送并且它们可体外导致CTG重复序列的删除。接下来，我们对于了解CTG删除是否会影响细胞核聚集点的存在有兴趣。因此，我们选择了用这两种载体在高MOI25和50下转导的DM1细胞，并且我们进行了FISH分析。未处理或仅用一种载体处理的DM1细胞用作对照。在通过共聚焦显微镜获取图像之后，我们手动计数聚集点消失的细胞的数量，并将该数量以整个群体的百分比报告图6C。要注意，并非所有细胞都被这两种慢病毒载体感染，因此如果对双阳性细胞Cas9-sgRNA进行归一化，图6C中报道的百分比将更高。如同对PCR删除所观察到的，聚集点的消失也与接种的病毒粒子的量相关，并且在最高MOIMOI50下，没有聚集点的细胞数量更高。我们的数据显示，CRISPR-Cas9介导的CTG重复序列切除决定了细胞核中聚集点的消失。AAVCas9和sgRNA诱导DMSXL小鼠中体内删除CTG重复序列扩张区为了验证我们的sgRNA对在体内诱导CTG重复序列删除的能力，我们选择了DMSXL小鼠作为DM1疾病的动物模型Huguet等人，2012。DMSXL小鼠带有一个拷贝的有约1200个CTG重复序列的人DMPK基因，并再现了人类病理学的许多特征。为了将CRISPR-Cas9系统递送到DMSXL小鼠的肌肉组织中，我们构建了用于SaCas9和sgRNA的腺相关病毒AAV载体。已知AAV有效感染肌肉，但它们的包装容量有限，约4.7KbWarrington等人，2006；Buj-Bello等人，2008。出于这个原因，我们设计了两种AAV，一种用于Cas9，另一种用于两个串联的sgRNA。SaCas9在SPc5-12的控制下，SPc5-12是一种合成的小启动子，其在肌肉中驱动转基因的良好表达Li等人，1999。与sgRNA对8B-12及其U6启动子相关的序列从相应的慢病毒构建体图6进行PCR扩增，并克隆到AAV质粒中Desmin启动子驱动的eGFP-K表达盒的多腺苷酸化序列下游，其中K是用于核膜定位的Kash肽图7A。用于Cas9和sgRNA8B-12的两种AAV已被共注射到6周龄杂合DMSXL小鼠的左侧胫骨前肌TA中。四周后，对小鼠实施安乐死并收集肌肉。为了检测CTG重复序列删除，用从TA提取的基因组DNA以及引物F1-DMPK-3UTR和R2-DMPK-3UTR进行PCR参见材料和方法。来自仅用PBS注射的右侧TA的gDNA用作阴性对照-。基因组PCR的结果呈现在图7中并且它们相对于用两种不同剂量1*10^11B和2*10^11C总Vg注射的小鼠。所有注射了AAVCas9-sgRNA+的TA显示出对应于具有CTG重复序列删除的扩增子的预期大小794bp的PCR条带。此外，一些未处理和处理的TA-和+显示出一些小于未经删除的PCR产物4200bp的预期大小的细条带。它们很可能代表含有CTG重复序列扩张区的未经删除的基因组区域的未完成扩增。我们的结果证明，Cas9与sgRNA8B-12对一起，能够体内删除DMSXL小鼠模型中人DMPK基因的3'-UTR处的长CTG重复序列扩张区。序列表吉尼松公司（GENETHON）等用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法B2346PC0088PatentInversion3.5122RNA人工序列向导序列sgRNA11gccccggagucgaagacaguuc22221RNA人工序列向导序列sgRNA42caguucacaaccgcuccgagc21321RNA人工序列向导序列sgRNA73gcggccggcgaacggggcucg21422RNA人工序列向导序列sgRNA8B4ggcucgaaggguccuuguagcc22521RNA人工序列向导序列sgRNA125cuuugcgaaccaacgauaggu21624RNA人工序列向导序列sgRNA12B6gcacuuugcgaaccaacgauaggu24781RNA人工序列SasgRNA恒定部分7guuuuaguacucuggaaacagaaucuacuaaaacaaggcaaaaugccguguuuaucucgu60caacuuguuggcgagauuuuu81815RNA人工序列最小向导序列sgRNA18agucgaagacaguuc15915RNA人工序列最小向导序列sgRNA49acaaccgcuccgagc151015RNA人工序列最小向导序列sgRNA710ggcgaacggggcucg151115RNA人工序列最小向导序列sgRNA8B11aggguccuuguagcc151215RNA人工序列最小向导序列sgRNA12和12B12gaaccaacgauaggu1513103DNA人工序列编码序列SasgRNA113gccccggagtcgaagacagttcgttttagtactctggaaacagaatctactaaaacaagg60caaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttt10314103DNA人工序列编码序列SasgRNA414gcagttcacaaccgctccgagcgttttagtactctggaaacagaatctactaaaacaagg60caaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttt10315102DNA人工序列编码序列SasgRNA715gcggccggcgaacggggctcggttttagtactctggaaacagaatctactaaaacaaggc60aaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttt10216103DNA人工序列编码序列SasgRNA8B16ggctcgaagggtccttgtagccgttttagtactctggaaacagaatctactaaaacaagg60caaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttt10317103DNA人工序列编码序列SasgRNA1217gctttgcgaaccaacgataggtgttttagtactctggaaacagaatctactaaaacaagg60caaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttt10318105DNA人工序列编码序列SasgRNA12B18gcactttgcgaaccaacgataggtgttttagtactctggaaacagaatctactaaaacaa60ggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttt10519249DNA人工序列U6启动子19gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagag60ataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtaga120aagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcat180atgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaagga240cgaaacacc2492022RNA人工序列向导序列sgRNA4+G20gcaguucacaaccgcuccgagc222122RNA人工序列向导序列sgRNA12+G21gcuuugcgaaccaacgauaggu222222DNA人工序列前间区序列122gccccggagtcgaagacagttc222322DNA人工序列前间区序列423gcagttcacaaccgctccgagc222421DNA人工序列前间区序列724gcggccggcgaacggggctcg212522DNA人工序列前间区序列8B25ggctcgaagggtccttgtagcc222622DNA人工序列前间区序列1026gcggccaggctgaggccctgac222722DNA人工序列前间区序列1227gctttgcgaaccaacgataggt222824DNA人工序列前间区序列12B28gcactttgcgaaccaacgataggt242924DNA人工序列前间区序列15B29ggggggcgcgggatccccgaaaaa243021DNA人工序列前间区序列17A30ggctccgcccgcttcggcggt213124DNA人工序列前间区序列17B31gccggctccgcccgcttcggcggt243222DNA人工序列前间区序列1932gaaaacgtggattggggttgtt223322DNA人工序列前间区序列2233ggggtctcagtgcatccaaaac223428DNA人工序列基因组靶序列+PAM134gccccggagtcgaagacagttctagggt283527DNA人工序列基因组靶序列+PAM435cagttcacaaccgctccgagcgtgggt273627DNA人工序列基因组靶序列+PAM736gcggccggcgaacggggctcgaagggt273728DNA人工序列基因组靶序列+PAM8B37ggctcgaagggtccttgtagccgggaat283827DNA人工序列基因组靶序列+PAM1038cggccaggctgaggccctgacgtggat273927DNA人工序列基因组靶序列+PAM1239ctttgcgaaccaacgataggtgggggt274030DNA人工序列基因组靶序列+PAM12B40gcactttgcgaaccaacgataggtgggggt304130DNA人工序列基因组靶序列+PAM15B41ggggggcgcgggatccccgaaaaagcgggt304227DNA人工序列基因组靶序列+PAM17A42ggctccgcccgcttcggcggtttggat274330DNA人工序列基因组靶序列+PAM17B43gccggctccgcccgcttcggcggtttggat304427DNA人工序列基因组靶序列+PAM1944aaaacgtggattggggttgttgggggt274528DNA人工序列基因组靶序列+PAM2245ggggtctcagtgcatccaaaacgtggat2846755DNA人工序列DMPK3'-UTR从终止密码子到polyA46tgaaccctagaactgtcttcgactccggggccccgttggaagactgagtgcccggggcac60ggcacagaagccgcgcccaccgcctgccagttcacaaccgctccgagcgtgggtctccgc120ccagctccagtcctgtgatccgggcccgccccctagcggccggggagggaggggccgggt180ccgcggccggcgaacggggctcgaagggtccttgtagccgggaatgctgctgctgctgct240gctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctggggggatcacagac300catttctttctttcggccaggctgaggccctgacgtggatgggcaaactgcaggcctggg360aaggcagcaagccgggccgtccgtgttccatcctccacgcacccccacctatcgttggtt420cgcaaagtgcaaagctttcttgtgcatgacgccctgctctggggagcgtctggcgcgatc480tctgcctgcttactcgggaaatttgcttttgccaaacccgctttttcggggatcccgcgc540ccccctcctcacttgcgctgctctcggagccccagccggctccgcccgcttcggcggttt600ggatatttattgacctcgtcctccgactcgctgacaggctacaggacccccaacaacccc660aatccacgttttggatgcactgagaccccgacattcctcggtatttattgtctgtcccca720cctaggacccccacccccgaccctcgcgaataaaa755471114PRT人工序列来自质粒Addgene61591的SaCas947MetAlaProLysLysLysArgLysValGlyIleHisGlyValProAla151015AlaLysArgAsnTyrIleLeuGlyLeuAspIleGlyIleThrSerVal202530GlyTyrGlyIleIleAspTyrGluThrArgAspValIleAspAlaGly354045ValArgLeuPheLysGluAlaAsnValGluAsnAsnGluGlyArgArg505560SerLysArgGlyAlaArgArgLeuLysArgArgArgArgHisArgIle65707580GlnArgValLysLysLeuLeuPheAspTyrAsnLeuLeuThrAspHis859095SerGluLeuSerGlyIleAsnProTyrGluAlaArgValLysGlyLeu100105110SerGlnLysLeuSerGluGluGluPheSerAlaAlaLeuLeuHisLeu115120125AlaLysArgArgGlyValHisAsnValAsnGluValGluGluAspThr130135140GlyAsnGluLeuSerThrLysGluGlnIleSerArgAsnSerLysAla145150155160LeuGluGluLysTyrValAlaGluLeuGlnLeuGluArgLeuLysLys165170175AspGlyGluValArgGlySerIleAsnArgPheLysThrSerAspTyr180185190ValLysGluAlaLysGlnLeuLeuLysValGlnLysAlaTyrHisGln195200205LeuAspGlnSerPheIleAspThrTyrIleAspLeuLeuGluThrArg210215220ArgThrTyrTyrGluGlyProGlyGluGlySerProPheGlyTrpLys225230235240AspIleLysGluTrpTyrGluMetLeuMetGlyHisCysThrTyrPhe245250255ProGluGluLeuArgSerValLysTyrAlaTyrAsnAlaAspLeuTyr260265270AsnAlaLeuAsnAspLeuAsnAsnLeuValIleThrArgAspGluAsn275280285GluLysLeuGluTyrTyrGluLysPheGlnIleIleGluAsnValPhe290295300LysGlnLysLysLysProThrLeuLysGlnIleAlaLysGluIleLeu305310315320ValAsnGluGluAspIleLysGlyTyrArgValThrSerThrGlyLys325330335ProGluPheThrAsnLeuLysValTyrHisAspIleLysAspIleThr340345350AlaArgLysGluIleIleGluAsnAlaGluLeuLeuAspGlnIleAla355360365LysIleLeuThrIleTyrGlnSerSerGluAspIleGlnGluGluLeu370375380ThrAsnLeuAsnSerGluLeuThrGlnGluGluIleGluGlnIleSer385390395400AsnLeuLysGlyTyrThrGlyThrHisAsnLeuSerLeuLysAlaIle405410415AsnLeuIleLeuAspGluLeuTrpHisThrAsnAspAsnGlnIleAla420425430IlePheAsnArgLeuLysLeuValProLysLysValAspLeuSerGln435440445GlnLysGluIleProThrThrLeuValAspAspPheIleLeuSerPro450455460ValValLysArgSerPheIleGlnSerIleLysValIleAsnAlaIle465470475480IleLysLysTyrGlyLeuProAsnAspIleIleIleGluLeuAlaArg485490495GluLysAsnSerLysAspAlaGlnLysMetIleAsnGluMetGlnLys500505510ArgAsnArgGlnThrAsnGluArgIleGluGluIleIleArgThrThr515520525GlyLysGluAsnAlaLysTyrLeuIleGluLysIleLysLeuHisAsp530535540MetGlnGluGlyLysCysLeuTyrSerLeuGluAlaIleProLeuGlu545550555560AspLeuLeuAsnAsnProPheAsnTyrGluValAspHisIleIlePro565570575ArgSerValSerPheAspAsnSerPheAsnAsnLysValLeuValLys580585590GlnGluGluAsnSerLysLysGlyAsnArgThrProPheGlnTyrLeu595600605SerSerSerAspSerLysIleSerTyrGluThrPheLysLysHisIle610615620LeuAsnLeuAlaLysGlyLysGlyArgIleSerLysThrLysLysGlu625630635640TyrLeuLeuGluGluArgAspIleAsnArgPheSerValGlnLysAsp645650655PheIleAsnArgAsnLeuValAspThrArgTyrAlaThrArgGlyLeu660665670MetAsnLeuLeuArgSerTyrPheArgValAsnAsnLeuAspValLys675680685ValLysSerIleAsnGlyGlyPheThrSerPheLeuArgArgLysTrp690695700LysPheLysLysGluArgAsnLysGlyTyrLysHisHisAlaGluAsp705710715720AlaLeuIleIleAlaAsnAlaAspPheIlePheLysGluTrpLysLys725730735LeuAspLysAlaLysLysValMetGluAsnGlnMetPheGluGluLys740745750GlnAlaGluSerMetProGluIleGluThrGluGlnGluTyrLysGlu755760765IlePheIleThrProHisGlnIleLysHisIleLysAspPheLysAsp770775780TyrLysTyrSerHisArgValAspLysLysProAsnArgGluLeuIle785790795800AsnAspThrLeuTyrSerThrArgLysAspAspLysGlyAsnThrLeu805810815IleValAsnAsnLeuAsnGlyLeuTyrAspLysAspAsnAspLysLeu820825830LysLysLeuIleAsnLysSerProGluLysLeuLeuMetTyrHisHis835840845AspProGlnThrTyrGlnLysLeuLysLeuIleMetGluGlnTyrGly850855860AspGluLysAsnProLeuTyrLysTyrTyrGluGluThrGlyAsnTyr865870875880LeuThrLysTyrSerLysLysAspAsnGlyProValIleLysLysIle885890895LysTyrTyrGlyAsnLysLeuAsnAlaHisLeuAspIleThrAspAsp900905910TyrProAsnSerArgAsnLysValValLysLeuSerLeuLysProTyr915920925ArgPheAspValTyrLeuAspAsnGlyValTyrLysPheValThrVal930935940LysAsnLeuAspValIleLysLysGluAsnTyrTyrGluValAsnSer945950955960LysCysTyrGluGluAlaLysLysLeuLysLysIleSerAsnGlnAla965970975GluPheIleAlaSerPheTyrAsnAsnAspLeuIleLysIleAsnGly980985990GluLeuTyrArgValIleGlyValAsnAsnAspLeuLeuAsnArgIle99510001005GluValAsnMetIleAspIleThrTyrArgGluTyrLeuGluAsn101010151020MetAsnAspLysArgProProArgIleIleLysThrIleAlaSer102510301035LysThrGlnSerIleLysLysTyrSerThrAspIleLeuGlyAsn104010451050LeuTyrGluValLysSerLysLysHisProGlnIleIleLysLys105510601065GlyLysArgProAlaAlaThrLysLysAlaGlyGlnAlaLysLys107010751080LysLysGlySerTyrProTyrAspValProAspTyrAlaTyrPro108510901095TyrAspValProAspTyrAlaTyrProTyrAspValProAspTyr110011051110Ala4822DNA人工序列编码序列向导序列sgRNA148gccccggagtcgaagacagttc224922DNA人工序列编码序列向导序列sgRNA449gcagttcacaaccgctccgagc225021DNA人工序列编码序列向导序列sgRNA750gcggccggcgaacggggctcg215122DNA人工序列编码序列向导序列sgRNA8B51ggctcgaagggtccttgtagcc225222DNA人工序列编码序列向导序列sgRNA1252gctttgcgaaccaacgataggt225324DNA人工序列编码序列向导序列sgRNA12B53gcactttgcgaaccaacgataggt245481DNA人工序列sgRNA恒定部分（如在质粒中）54gttttagtactctggaaacagaatctactaaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgt60caacttgttggcgagattttt815540DNA人工序列引物55cgctcgagcgccggcgtgaggctccggtgcccgtcagtgg405643DNA人工序列引物56cgcccgggtcgcgatcacgacacctgtgttctggcggcaaacc435730DNA人工序列5757gcgaccggtgccaccatggccccaaagaag305844DNA人工序列引物58cgcgtcgaccttaagcgtaatctggaacatcgtatgggtaagcg445932DNA人工序列引物59gcggtttaaacgccaccatggccccaaagaag326039DNA人工序列引物60ccgcggccgcgcgagctctaggaattcttaagcgtaatc396138DNA人工序列引物61ggaggtaccttaagcaattggacatagtcgtttaaacc386231DNA人工序列引物62cctcacgtgtcctgcggccgcaaaaatctcg316325DNA人工序列引物63caccgcggccggcgaacggggctcg256425DNA人工序列引物64aaaccgagccccgttcgccggccgc256526DNA人工序列引物65caccggctcgaagggtccttgtagcc266626DNA人工序列引物66aaacggctacaaggacccttcgagcc266726DNA人工序列引物67caccgcggccaggctgaggccctgac266826DNA人工序列引物68aaacgtcagggcctcagcctggccgc266926DNA人工序列引物69caccgctttgcgaaccaacgataggt267026DNA人工序列引物70aaacacctatcgttggttcgcaaagc267128DNA人工序列引物71caccgcactttgcgaaccaacgataggt287228DNA人工序列引物72aaacacctatcgttggttcgcaaagtgc287328DNA人工序列引物73caccggggggcgcgggatccccgaaaaa287428DNA人工序列引物74aaactttttcggggatcccgcgcccccc287525DNA人工序列引物75caccggctccgcccgcttcggcggt257625DNA人工序列引物76aaacaccgccgaagcgggcggagcc257728DNA人工序列引物77caccgccggctccgcccgcttcggcggt287828DNA人工序列引物78aaacaccgccgaagcgggcggagccggc287926DNA人工序列引物79caccgaaaacgtggattggggttgtt268026DNA人工序列引物80aaacaacaaccccaatccacgttttc268126DNA人工序列引物81caccggggtctcagtgcatccaaaac268226DNA人工序列引物82aaacgttttggatgcactgagacccc268321DNA人工序列引物83gttcgccgttgttctgtctcg218421DNA人工序列引物84tccagagctttgggcagatgg218530DNA人工序列引物85ccgggtaccgttcgccgttgttctgtctcg308631DNA人工序列引物86ccgctctagatccagagctttgggcagatgg318721DNA人工序列引物87gtcccaggagccaatcagagg218821DNA人工序列引物88ctagctcctcccagaccttcg21

权利要求：1.一种sgRNA分子对，其中所述对包含能够通过碱基配对与靶基因组DNA序列的互补序列结合的第一sgRNA分子和第二sgRNA分子，所述第一sgRNA分子和第二sgRNA分子分别位于定位在DMPK基因的3'-非翻译区3'-UTR内的核苷酸重复序列扩张区的5'和3'，其中所述第一sgRNA分子能够在Cas9内切核酸酶的存在下在所述3'-UTR内诱导所述核苷酸重复序列扩张区的5'的双链断裂；其中所述第二sgRNA分子能够在Cas9内切核酸酶的存在下在所述3'-UTR内诱导所述核苷酸重复序列扩张区的3'的双链断裂；其中所述Cas9内切核酸酶源自于金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusSaCas9，或其中所述Cas9内切核酸酶是SaCas9的功能性变体；其中所述第二sgRNA分子包含15-40个核苷酸的向导序列，所述向导序列包含SEQIDNO：12中所示的核苷酸序列。2.权利要求1的sgRNA对，其中所述第一sgRNA包含长度为15-40个核苷酸的向导序列，所述向导序列包含SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10或SEQIDNO：11中所示的核苷酸序列。3.权利要求1或2的sgRNA对，其中所述第一sgRNA的向导序列由选自SEQIDNO：1-4和SEQIDNO：20的核苷酸序列组成。4.权利要求1-3任一项的sgRNA对，其中所述第二sgRNA的向导序列由选自SEQIDNO：5、SEQIDNO：6和SEQIDNO：21的核苷酸序列组成。5.一种sgRNA，其包含能够通过碱基配对与靶基因组DNA序列的互补序列结合的序列，所述靶基因组DNA序列位于DMPK基因的3'-UTR内的核苷酸重复序列扩张区的5'或3'；其中所述sgRNA分子能够在源自于金黄色葡萄球菌的Cas9内切核酸酶SaCas9或作为SaCas9的功能性变体的Cas9内切核酸酶存在下在所述3'-UTR内诱导所述核苷酸重复序列扩张区的5'或3'的双链断裂；其中所述sgRNA包含15-40个核苷酸的向导序列，所述向导序列包含选自SEQIDNO：8-12的序列。6.权利要求5的sgRNA，其中所述sgRNA包含选自SEQIDNO：1-6、SEQIDNO：20和SEQIDNO：21的向导序列。7.一种编码权利要求1至6任一项的sgRNA或sgRNA分子对的载体，所述载体优选是质粒或病毒载体，例如rAAV载体或慢病毒载体。8.一种靶细胞，其用权利要求7的载体转染或转导。9.一种用于产生sgRNA或sgRNA对的方法，所述方法包括在允许产生所述sgRNA或sgRNA对的条件下培养权利要求8的靶细胞，并从所述培养步骤中回收所述sgRNA或所述sgRNA分子对。10.一种用于切除位于细胞中DMPK基因的非编码区内的核苷酸重复序列的体外方法，所述方法包括在所述细胞中引入权利要求1-4任一项的sgRNA分子对或权利要求7的载体，以及源自于金黄色葡萄球菌S.aureus的CRISPRCas9内切核酸酶。11.权利要求1-4任一项的sgRNA对或权利要求7的载体，其与源自于金黄色葡萄球菌的Cas9内切核酸酶组合用作药物。12.权利要求1-4任一项的sgRNA对或权利要求7的载体，其与源自于金黄色葡萄球菌的Cas9内切核酸酶组合用于治疗1型肌强直性营养不良的方法中。13.权利要求12的供使用的sgRNA对，其中所述核苷酸重复序列扩张区是位于DMPK基因的3'-UTR内的双、三、四、五或六核苷酸重复序列扩张区，特别是三核苷酸重复序列扩张区。14.权利要求13的供使用的sgRNA对，其中所述核苷酸重复序列扩张区包含20个或更多的重复序列，例如20至10000个重复序列，更特别是50至5000个重复序列。15.一种药物组合物，其包含权利要求1至6任一项的sgRNA或sgRNA分子对或权利要求7的载体，或源自于金黄色葡萄球菌的CRISPRCas9内切核酸酶，或权利要求8的细胞。

百度查询： 吉尼松公司;法国国家卫生及研究医学协会 用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法

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