申请/专利权人：河南师范大学

申请日：2023-11-29

公开（公告）日：2024-03-15

公开（公告）号：CN117701752A

主分类号：C12Q1/6895

分类号：C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/645

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.02#实质审查的生效;2024.03.15#公开

摘要：本发明公开了一种基于RPA‑CRISPRCas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其具体过程为：以链格孢菌菌落或疑似感染链格孢菌的山药新鲜叶片为材料进行DNA粗提取制得DNA粗制提取液，再将DNA粗制提取液加入到RPA扩增体系进行扩增反应，扩增反应结束后将RPA扩增产物加入到CRISPRCas12a反应体系中进行反应，再将其置于蓝光LED灯下照射进行检测，发出蓝绿光为阳性结果，无发光为阴性结果。本发明无需复杂的大型实验室仪器、实时迅速、并以可视化形式观察测试结果，能够在实验室与非实验室环境（如田间）实现山药黑斑病病原真菌‑链格孢菌的快速特异性检测。

主权项：1.基于RPA-CRISPRCas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于具体过程为：以链格孢菌菌落或疑似感染链格孢菌的山药新鲜叶片为材料进行DNA粗提取制得DNA粗制提取液，再将DNA粗制提取液加入到RPA扩增体系进行扩增反应，扩增反应结束后将RPA扩增产物加入到CRISPRCas12a反应体系中进行反应，再将反应体系置于蓝光LED灯下照射进行检测，发出蓝绿光为阳性结果，无发光为阴性结果；所述RPA扩增体系中RPA引物序列为： Al-RF5’-CCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTC-3’； Al-RR5’-GGCTTAATGGATGCTAGACCTTTGCTGATAGAGA-3’；所述CRISPRCas12a反应体系的组成为：NEBuffer42μL、crRNA0.025μmol·L-1、Cas12a重组蛋白0.05μmol·L-1、RNaseinhibitor10U、荧光探针4μmol·L-1，RNasefreeddH2O补至17μL，将混合组分置于37℃加热5min，促进crRNA与Cas12a形成二元复合物即形成CRISPRCas12a反应体系；其中crRNA的全长核苷酸序列为：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGGAGCGCAGCACAAGUCGCACU-3’；荧光探针选用TaqMan探针，该荧光探针序列为5’-FAM-TTATT-BHQ-3’。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 河南师范大学 基于RPA-CRISPR/Cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法

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