申请/专利权人：江南大学

申请日：2023-04-27

公开（公告）日：2024-03-15

公开（公告）号：CN116334105B

主分类号：C12N15/52

分类号：C12N15/52;C12N15/70;C12N15/78;C12N15/67;C12R1/19;C12R1/40

优先权：["20230110 CN 2023100309565"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.15#授权;2023.07.14#实质审查的生效;2023.06.27#公开

摘要：本发明公开了一种恶臭假单胞菌中4‑异丙基苯甲酸诱导的高强度表达体系的构建方法，以恶臭假单胞菌F1（PseudomonasPutidaF1）代谢途径中存在的4‑异丙基苯甲酸（cumate）诱导的cym操纵子为基础，替换其原有表达用启动子以及表达目的基因，通过组合多阻遏位点，得到改造后的cym操纵子，从而使得荧光蛋白表达强度提高；本发明确定了所述诱导系统的诱导剂在恶臭假单胞菌中的有效响应范围，同时筛选得到响应最好的多阻遏位点诱导系统。

主权项：1.一种基于4-异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子的改造方法，其特征在于：包括，对4-异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子原有表达用启动子以及表达目的基因进行替换，再组合阻遏位点，即得到改造后的cmt操纵子，作为诱导系统应用于恶臭假单胞菌KT2440中被4-异丙基苯甲酸诱导表达；其中，所述4-异丙基苯甲酸存在于恶臭假单胞菌F1（PseudomonasPutidaF1）代谢途径中，其诱导的cmt操纵子中的阻遏位点CuO2的序列如SEQIDNO:15所示；所述对4-异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子原有表达用启动子以及表达目的基因进行替换，包括，以质粒pBBR1-pTrc为模板，设计引物pBBR1vector-F、pBBR1vector-R通过PCR扩增抗性基因Kan、复制子pBBR1oriV、pBBR1Rep得到片段1;以恶臭假单胞菌F1纯化基因组为模板，设计引物cymR-F、cymR-R通过PCR扩增阻遏蛋白基因cymR得到片段2;设计引物CuO2-F、CuO2-R扩增cmt操纵子阻遏位点CuO2和启动子得到片段3；以pBBR1-CuO2-eGFP和pBBR1-cymR-CuO2-eGFP质粒为模板，设计引物tac-F、tac-R通过PCR扩增两个质粒载体，得到片段4和片段5；其中，所述引物pBBR1vector-F、pBBR1vector-R序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示；所述引物cymR-F、cymR-R序列如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示；所述引物CuO2-F、CuO2-R序列如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6所示；所述引物为tac-F、tac-R序列如SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示片段1和片段3进行Gibson组装，片段1、片段2和片段3进行Gibson组装，连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布培养，获得转化子；挑取转化子单菌落，再次培养后提取质粒，即得到pBBR1-CuO2-eGFP和pBBR1-cymR-CuO2-eGFP质粒；片段4、片段5分别进行Gibson组装，得到pBBR1-Ptac-CuO2-eGFP、pBBR1-cymR-Ptac-CuO2-eGFP质粒，序列分别如SEQIDNO:9、SEQIDNO:10所示；所述组合阻遏位点包括组合单阻遏位点和多阻遏位点，其中，所述组合阻遏位点，包括，以pBBR1-Ptac-CuO2-eGFP和pBBR1-cymR-Ptac-CuO2-eGFP质粒为模板，设计引物CuO2-vector-F、CuO2-vector-R通过PCR扩增两个质粒载体，得到片段6和片段7，其中，所述引物为CuO2-vector-F、CuO2-vector-R，序列如SEQIDNO:11、SEQIDNO:12所示；设计引物2CuO2-F、2CuO2-R、3CuO2-F、3CuO2-R分别在相应位置添加阻遏位点CuO2，得到片段8、片段9，序列如SEQIDNO:13、SEQIDNO:14所示；片段6和片段8、片段6和片段9、片段7和片段8、片段7和片段9分别进行Gibson组装，连接产物分别转化大肠杆菌JM109，涂布培养，获得转化子；挑取转化子单菌落，再次培养后提取质粒，即得到pBBR1-Ptac-2CuO2-eGFP、pBBR1-cymR-Ptac-2CuO2-eGFP、pBBR1-Ptac-3CuO2-eGFP、pBBR1-cymR-Ptac-3CuO2-eGFP质粒；所述改造后的cmt操纵子质粒模型包括，pBBR1-Ptac-CuO2-eGFP、pBBR1-cymR-Ptac-CuO2-eGFP、pBBR1-Ptac-2CuO2-eGFP、pBBR1-cymR-Ptac-2CuO2-eGFP、pBBR1-Ptac-3CuO2-eGFP、pBBR1-cymR-Ptac-3CuO2-eGFP，其中，pBBR1-cymR-Ptac-2CuO2-eGFP在恶臭假单胞菌KT2440中响应效果最好，在4-异丙基苯甲酸诱导浓度为400mgL时达到最高荧光蛋白表达强度。

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百度查询： 江南大学 一种基于4-异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子的改造方法

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