申请/专利权人：中国农业大学

申请日：2023-10-13

公开（公告）日：2024-03-15

公开（公告）号：CN117069817B

主分类号：C07K14/415

分类号：C07K14/415;C12N15/29;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/82;C12Q1/6895;C12N15/11

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.15#授权;2023.12.05#实质审查的生效;2023.11.17#公开

摘要：本发明涉及植物分子低温胁迫领域，具体涉及一种通过过表达SlNAC3基因预报低温胁迫提早番茄耐低温方法；本方案通过过表达和野生型植株的低温处理，得到SlNAC3的过表达植株响应低温时间显著提前，对SlNAC3基因进行基因沉默，发现沉默植株具备耐冷性，并对以上植株进行了相对电导率、丙二醛含量和FvFm等生理指标的测定，本方案所涉及的SlNAC3新功能具有较好的应用潜力，为生产中预报低温胁迫、提早番茄冷响应，进而培育耐低温植物提供了基因资源和新思路，具有广泛的应用前景和较高的使用价值。

主权项：1.一种通过过表达SlNAC3基因预报低温胁迫提早番茄耐低温方法，其特征在于，所述番茄SlNAC3基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；该方法包括以下步骤：（1.1）合成番茄SINCA3基因的qRT-PCR引物序列：上游引物5‘-TGCCTCTGTTCCTCTTCCTG-3’；下游引物5‘-TCTTGTTCTCCAAATGTCGC-3’；（1.2）使用qRT-PCR法检测SlNAC3基因在番茄常温和冷处理条件下的相对表达量；该方法还包括番茄SlNAC3基因VIGS基因沉默植株获得方法，所述获得方法包括以下步骤：（2.1）构建pTRV2-SlNAC3载体，利用SGN数据库的VIGSTool功能筛选SlNAC3基因的400bp特异序列，以该序列为模板，设计引物序列：上游引物5‘-gtgagtaaggttaccgaattcACCAAATTCAATGTCAATGCCA-3’；下游引物5‘-cgtgagctcggtaccggatccTGCCTGAATAAGGTTGTCGAAA-3’；在扩增后对目的条带切胶，随后进行胶回收处理，将胶回收产物与酶切过的pTRV2载体进行同源重组；（2.2）番茄VIGS注射；（2.3）取叶片提取RNA进行RT-PCR筛选阳性植株，检测阳性植株的沉默效率，选取沉默效率大于50%的植株进行实验；随后分别进行过表达植株响应低温以及VIGS沉默植株响应低温的表型和生理分析；该方法还包括用于扩增番茄SlNAC3基因全长的引物，该引物为：上游引物5‘-ATGGAGAGTACCGATTCATCAA-3’；下游引物5‘-TTAAGAGTACCAATTCATGCCT-3’；该方法还包括番茄SlNAC3过表达植株获得方法，采用上述的引物扩增，所述番茄SlNAC3过表达植株获得方法包括以下步骤：（4.1）利用RT-PCR将SlNAC3基因990bp的全长扩增，得到扩增产物；（4.2）确定酶切位点为XhoⅠ，随后将扩增产物连接到载体pENTR4上，在测序正确后提取质粒；（4.3）将质粒连接到CaMV35S启动子的载体pK7FWG2-eGFP上，在测序正确后提取质粒；（4.4）将连有SlNAC3的质粒pK7FWG2-eGFP通过化学转化法转入农杆菌GV3101感受态中，通过浸染番茄子叶的方法进行番茄的遗传转化；（4.5）通过对过表达载体上的GFP序列扩增以及植株SlNAC3的qRT-PCR检测获得三个SlNAC3基因的过表达株系OE#4、OE#5和OE#7。

全文数据：

权利要求：

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