申请/专利权人：杭州昱鼎生物科技有限公司

申请日：2022-01-11

公开（公告）日：2024-03-19

公开（公告）号：CN114397388B

主分类号：G01N30/02

分类号：G01N30/02;G01N30/06

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.19#授权;2022.05.13#实质审查的生效;2022.04.26#公开

摘要：本发明涉及一种试剂盒及应用，尤其涉及一种基于PEG沉淀法与SEC柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用。首次发现通过冻融尿液，可以析出大量的尿液结晶等杂质，通过低速离心去除，提高了后续外泌体提取的纯度。本发明通过流通液采点BCA检测蛋白浓度，成功避开空柱体积，以及在外泌体后流通下来的杂蛋白区域，进一步提高了提取的外泌体纯度。

主权项：1.一种基于PEG沉淀法与SEC柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒的使用方法，其特征在于按如下步骤进行实施：（1）、最佳选择新鲜晨尿，在2～8℃，150～500×g离心5～15min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液；（2）、将（1）中获得的尿液上清液，在2～8℃，1000～2000×g离心5～20min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液；（3）、将（2）中获得的尿液上清液，置于﹣20～-80℃冰箱中冷冻30min或以上，2～8℃或常温解冻后，重复（2）中离心步骤，在2～8℃，1000～2000×g离心5～20min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液；（4）、将（3）中获得的尿液上清液，转移到新的离心管；底部沉淀用DTT或TCEP处理，37℃摇床震荡孵育10～30min；（5）、将（3）中获得的尿液上清液，倒入（4）中沉淀处理后的离心管，加入适量PEG溶解并混匀，使得终浓度为5%～20%；（6）、将（5）中含5%～20%PEG的尿液，于4℃冰箱，静置过夜；在2～8℃，5000～10000×g离心30min～1h，弃尿液上清液，倒扣于吸水纸上5～10min；（7）、用移液枪吸取0.5～1ml的PBS溶液，反复吹打冲洗离心管中下端壁上和底部1～3min，收集悬浮沉淀；此处PBS溶液的pH值为7.2～7.4；（8）、将（7）中收集的悬浮沉淀置于低速离心机150～500×g旋转30s～1min，弃残留的PEG颗粒；收集上清，得到悬浮沉淀可置于-80摄氏度保存；（9）、SEC柱，经3倍柱体积PBS溶液润洗平衡，此处PBS溶液的pH值为7.2～7.4；底盖出口无液体流出后，封住底盖出口，准备好1.5～2ml离心管，按顺序写好编码；加入悬浮沉淀，打开底盖，按离心管编码顺序接取SEC柱流通液；待底盖出口无液体流出，再加洗脱液PBS溶液，此处PBS溶液的pH值为7.2～7.4；继续接取SEC柱流通液；除去空柱体积约1.5ml，收集所需外泌体的体积为空柱体积之后的1～2ml洗脱液；收集的外泌体于-80摄氏度保存。

全文数据：

权利要求：

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