申请/专利权人：苏州酶泰生物科技有限公司

申请日：2022-04-20

公开（公告）日：2024-03-19

公开（公告）号：CN114940985B

主分类号：C12N9/12

分类号：C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/32;C12R1/19

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.19#授权;2022.09.13#实质审查的生效;2022.08.26#公开

摘要：本发明公开了兼具脱氧腺苷二磷酸激酶和乙酸激酶活性的蛋白及应用，涉及生物工程领域，兼具脱氧腺苷二磷酸激酶和乙酸激酶活性的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；兼具脱氧腺苷二磷酸激酶和乙酸激酶活性的蛋白基因的碱基序列如SEQIDNO.2所示，蛋白的制备方法包括：重组菌株获取、重组菌株培养、诱导表达和提取蛋白。本发明的优点在于：提出一种兼具脱氧腺苷二磷酸激酶和乙酸激酶活性的蛋白，利用本发明提供的蛋白可实现一步二酶催化制备脱氧腺苷三磷酸，减少了催化用酶种类，简化了催化工艺过程，从更具有市场竞争力，并且所述生产脱氧腺苷三磷酸的方法适用于大规模工业化生产。

主权项：1.一种制备脱氧腺苷三磷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.向反应器中加入包含脱氧腺苷单磷酸、ATP和乙酰磷酸的溶液，调节所述溶液的pH至6.0；S2.向所述溶液中加入兼具脱氧腺苷二磷酸激酶和乙酸激酶活性的蛋白和脱氧腺苷单磷酸激酶，得到反应体系并搅拌均匀；S3.将所述反应体系在恒温水浴摇床中进行反应，摇床转速设置为50rpm，控制反应体系温度在40℃，保持反应体系的pH在6.0-7.0之间；S4.获得含脱氧腺苷三磷酸的粗溶液；S5.将所述粗溶液过滤，纯化，干燥，得到脱氧腺苷三磷酸；其中，所述的兼具脱氧腺苷二磷酸激酶和乙酸激酶活性的蛋白的制备方法包括如下步骤：重组菌株获取，根据兼具脱氧腺苷二磷酸激酶和乙酸激酶活性的蛋白的蛋白编码基因针对大肠杆菌做密码子优化，将优化后的DNA序列合成并重组到表达载体pET-22b含酶切位点BamHI、HindIII上，重组质粒转化至E.coliBL21，获得重组表达基因工程菌E.coliBL21-pET-22b-dACK；重组菌株培养，将上述含有所述蛋白编码基因的基因工程菌E.coliBL21-pET-22b-dACK接种到含有氨苄青霉素的5mLLB液体培养基的50mL的摇管中，在摇床上37℃恒温培养8h，转速200rpm；诱导表达，将培养菌液按2％接种量接入含有100mL诱导培养基TB中的500mL摇瓶中，于200rpm，37℃培养2h，待OD600达到0.2左右时转16℃诱导24h离心收集菌体；提取蛋白，超声破菌，离心取上清液为粗酶液dACK，置于4℃冰箱保存；所述兼具脱氧腺苷二磷酸激酶和乙酸激酶活性的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述兼具脱氧腺苷二磷酸激酶和乙酸激酶活性的蛋白的蛋白编码基因的碱基序列如SEQIDNO.2所示。

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