申请/专利权人：广东赛尔生物科技有限公司

申请日：2024-01-11

公开（公告）日：2024-03-19

公开（公告）号：CN117551603B

主分类号：C12N5/077

分类号：C12N5/077

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.19#授权;2024.03.01#实质审查的生效;2024.02.13#公开

摘要：一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，所属生物细胞培养技术领域，方法包括，真皮组织的提取、原代细胞的分离以及采用包被培养皿对原代细胞进行培养；包被培养皿的内壁具有包被膜，所述包被膜含有角鲨烷、依克多因、岩藻聚糖、β‑环糊精和卡拉胶。在分离过程中，利用添加适量的角鲨烷和依克多因保护成纤维细胞不受胶原酶IV消化的损伤，提高细胞健康活性；在培养过程中，通过制备包被培养皿，附有对细胞友好亲和的包被膜，促进成纤维细胞的贴壁和汇合，提高原代成纤维细胞培养的活性和收率，以及大幅缩短培养周期，进而提高培养效率和产量。

主权项：1.一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1，真皮组织的提取：采用dispaseⅡ消化液对皮肤组织进行消化后去除表皮部分，得到真皮组织；S2，原代细胞的分离：将真皮组织剪切成0.1cm2～0.3cm2的碎片，得到真皮组织碎片，然后加入胶原酶IV消化液、角鲨烷和依克多因，在36.5℃～37.5℃，进行水浴震荡酶解消化20min～30min，之后加入1.5倍～3倍体积的生理盐水终止酶解消化，离心分离，弃去上清液，之后采用生理盐水洗涤，离心分离，收集沉淀物；所述角鲨烷的添加量为真皮组织碎片质量的0.5%～5%；所述依克多因的添加量为真皮组织碎片质量的0.5%～5%；S3，原代细胞的培养：将沉淀物浮于培养基中，再转入包被培养皿中，在36.5℃～37.5℃，CO2体积浓度为5%～6%的培养箱中进行培养，18h～22h后进行换新培养基，并弃去未贴壁的细胞；继续培养，每隔24h～25h换新培养基，培养第5天～第6天，细胞汇合度达到80%～90%，即能够进行后续消化传代；所述包被培养皿的内壁具有包被膜，所述包被膜含有角鲨烷、依克多因、岩藻聚糖、β-环糊精和卡拉胶；所述包被培养皿的制备方法为，在培养皿内表面涂覆食品级硅胶溶液，凝固后形成一层食品级硅胶薄膜；然后在食品级硅胶薄膜表面涂覆一层复合液，干燥后形成一层包被膜；所述复合液的组成质量份数为，0.2份～0.5份角鲨烷、0.2份～0.5份依克多因、0.1份～0.5份岩藻聚糖、0.3份～0.8份β-环糊精、0.1份～1份卡拉胶和100份纯化水，所述复合液的温度为70℃～80℃；其中，S2中，所述胶原酶IV消化液的用量为真皮组织碎片质量的5倍～8倍；所述胶原酶IV消化液中胶原酶IV质量浓度为0.2%～0.4%。

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