申请/专利权人：山东师范大学

申请日：2021-10-14

公开（公告）日：2024-03-22

公开（公告）号：CN113957126B

主分类号：C12Q1/6823

分类号：C12Q1/6823;C12Q1/6886;C12N15/11

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.22#授权;2022.02.15#实质审查的生效;2022.01.21#公开

摘要：本发明属于生物技术领域，具体涉及一种错配的线性双链寡核苷酸探针及lncRNA的检测方法。本发明采用错配的线性双链寡核苷酸探针来直接检测体外或活细胞中的长链非编码RNAlncRNA，无需任何酶扩增，并且也不需要分离未结合的探针，在寡核苷酸探针中引入错配碱基可以提高对靶标lncRNA的链置换反应速率，具有背景信号低、检测灵敏度高的优势。错配的寡核苷酸探针可以检测各种细胞系中细胞内lncRNA的表达水平，并将癌细胞与正常细胞区分开来，为快速简便地检测活细胞中的低丰度核酸提供了一个有用的平台。

主权项：1.一种非诊断目的的体外活细胞中lncRNAHOTAIR的检测方法，其特征在于：所述检测方法的步骤为：（1）制备错配线性双链寡核苷酸探针：所述错配线性双链寡核苷酸探针由5'端用BHQ1修饰的捕获探针和3'端用FAM修饰的报告探针组成；捕获探针与报告探针部分杂交，形成具有两个错配碱基的错配线性双链寡核苷酸探针；（2）制备Opti-MEM转染混合物:将所述错配线性双链寡核苷酸探针、转染试剂和Opti-MEM混合，制备得到Opti-MEM转染混合物；（3）将活细胞与所述Opti-MEM转染混合物在加湿环境下进行孵育，获得孵育后的细胞；以及（4）对所述孵育后的细胞进行激光扫描显微镜成像；在没有靶标lncRNAHOTAIR的情况下，所述错配线性双链寡核苷酸探针结构的形成使猝灭剂BHQ1和荧光团FAM靠近，从而有效地猝灭荧光，处于OFF状态；在靶标lncRNAHOTAIR存在的情况下，所述错配双链寡核苷酸探针中的捕获探针与靶标lncRNAHOTAIR完全杂交并释放报告探针，从而在激发时发射荧光，处于ON状态，实现对靶标lncRNAHOTAIR的检测；在没有靶标lncRNAHOTAIR的情况下，所述错配线性双链寡核苷酸探针在37℃的生理温度下保持稳定，并且在37℃下区分完全匹配的靶标lncRNAHOTAIR；所述lncRNAHOTAIR的序列为5'-GCAACUCUAUAAUAUGCUUAUAUUAGGUCUAGAAG-3'；所述报告探针的序列为5'-G*C*T*TATTTTAGGACT*A*G*A-FAM-3',其中，*代表硫代修饰的寡核苷酸，所述_代表错配的碱基；所述捕获探针的序列为5'-BHQ1-T*C*T*A*G*ACCTAATATAAGCATATTATAGAG*T*T*G*C-3',其中，*代表硫代修饰的寡核苷酸；所述错配线性双链寡核苷酸探针能区别不同活细胞中lncRNAHOTAIR表达量的不同，将癌细胞与正常细胞区分开来，且能检测到正常细胞中低表达量的lncRNAHOTAIR。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 山东师范大学 错配的线性双链寡核苷酸探针及lncRNA的检测方法

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