申请/专利权人：江西农业大学

申请日：2023-11-09

公开（公告）日：2024-03-05

公开（公告）号：CN117646018A

主分类号：C12N15/74

分类号：C12N15/74;C12N15/66;C12N15/54;C12R1/01

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.03.22#实质审查的生效;2024.03.05#公开

摘要：本发明公开了一种多重耐药寡养单胞菌的基因敲除方法，以多重耐药MER1原始菌株，不残留额外抗生素耐药筛选标记，实现多重耐药菌中基因的无痕敲除。构建目的基因的新型自杀性敲除载体，利用热转法将导入同源臂后的敲除载体转化到大肠杆菌营养缺陷菌株WM3064中，利用载体上的CmR抗性基因，筛选出单交换后质粒插入的转化子；将该菌株过夜扩培后，利用载体上携带的sacB自杀基因进行反筛，即目的基因随整合入基因组的质粒载体环出后实现无痕脱落，本发明不引入抗生素耐药标签和外源序列，实现基因无缝敲除操作更为便捷高效，有助于后续基因的组合敲除和多位点编辑。

主权项：1.一种多重耐药寡养单胞菌的基因敲除方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、构建重组自杀载体：设计反向PCR引物扩增缺失抗性标签的线性化载体，与从pBAD33克隆到的抗性基因通过一步克隆体外连接，利用热转法导入到E.coliDH5ɑ，涂布在含有相应抗生素培养平板上挑取转化子并进行验证，构建载体命名为pEX18Tc-CmR；S2、构建目的基因的敲除载体：设计待敲除目的基因上下游同源臂扩增引物，在上游同源臂选择BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，插入片段1连接上游同源臂U，插入片段2连接下游同源臂D；进行PCR扩增出目的基因的上下游同源臂U、D后，利用一步克隆法技术在体外将其与BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的线性化载体pEX18Tc-CmR连接；S3、构建基因敲除菌株：利用热转法将敲除载体转化到大肠杆菌2,6-二氨基庚二酸营养缺陷Δdap菌株WM3064中，培养需加入2,6-二氨基庚二酸2,6-DAP，以此为供体菌，寡养单胞菌MER1为受体菌，进行双亲本接合；之后，由于自杀质粒载体pEX18Tc-CmR无法在寡养单胞菌中独立复制，其接合转化到宿主菌株后会插入到MER1的基因组上；利用载体上的氯霉素Chl抗性基因，筛选出第一次交换的重组转化子；S4、将步骤S3获得的菌株过夜扩培后，利用载体上携带的反筛选标记sacB基因，在反筛选平板上筛选发生第二次交换的重组子，即已整合入基因组、携带同源臂并缺失目的基因DNA片段随质粒载体从基因组环出脱落，实现基因无缝敲除。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 江西农业大学 一种多重耐药寡养单胞菌的基因敲除方法

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