申请/专利权人：青岛华大智造科技有限责任公司

申请日：2017-12-27

公开（公告）日：2024-04-23

公开（公告）号：CN110114476B

主分类号：C12Q1/6869

分类号：C12Q1/6869

优先权：["20161227 CN PCT/CN2016/112402"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.23#授权;2023.10.31#专利申请权的转移;2019.12.17#专利申请权的转移;2019.09.03#实质审查的生效;2019.08.09#公开

摘要：提供了一种基于单荧光染料的测序方法。此外，还提供了一种经修饰的核苷和核苷酸以及包含所述核苷和或核苷酸的试剂盒，其特别适合用于所述的测序方法。此外，还提供了所述核苷、核苷酸和试剂盒用于测序的用途。

主权项：1.一种对核酸分子进行测序的方法，其包括以下步骤：1提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；2添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式I、式II、式III和式IV所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系： 其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、TU、C和G；R1各自独立地选自-H，单磷酸基团，二磷酸基团，三磷酸基团和四磷酸基团；R2各自独立地选自-H和-OH；R3a,R3b,R3c,和R3d为-CH2-N3；R4a和R4b为R5a为R5b为L1各自独立地为连接基团或不存在；L2各自独立地为连接基团或不存在；Dye表示能够发出荧光信号的荧光基团；R7a为Dye1，并且，Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱；3使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；4在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；5移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；6使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团的试剂发生第一生物正交连接反应，从而将所述试剂中的荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号，所述荧光基团为与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的结构不同但发射光谱相同的荧光基团；并且所述处理能够使第四化合物中的R5b发生生物正交切割反应，从而去除第四化合物中的荧光基团；和7移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；8使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团，如果存在的话；9移除前一步骤的反应体系的溶液相；10添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤4-7；11重复进行步骤8-10一次或多次；Dye和R7a为AF532，和或，所述携带荧光基团的试剂为1,2,4,5-四嗪衍生物，其结构为： 所述第一化合物的结构如式Ia所示： 所述第二化合物的结构如式IIa所示： 所述第三化合物的结构如式IIIa所示： 所述第四化合物的结构如式IVa所示：

全文数据：PCT国内申请，说明书已公开。

权利要求：PCT国内申请，权利要求书已公开。

百度查询： 青岛华大智造科技有限责任公司 一种基于单荧光染料的测序方法

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