申请/专利权人：艾滋基金研究所

申请日：2017-07-26

公开（公告）日：2024-03-22

公开（公告）号：CN110087679B

主分类号：A61K39/21

分类号：A61K39/21;C07K14/16;A61K39/12;A61K39/00

优先权：["20160727 EP EP16382364.4"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.22#授权;2019.09.27#著录事项变更;2019.09.24#著录事项变更;2019.08.27#实质审查的生效;2019.08.02#公开

摘要：本发明涉及包含目标多肽、跨膜结构域和HIVgag多肽、或它们的功能等同变体的融合蛋白。本发明还涉及表达或呈递所述融合蛋白的多核苷酸、载体、宿主细胞和病毒样颗粒和涉及包含所述融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞和病毒样颗粒的药学、免疫原性、或疫苗组合物以及其在人类医学和兽医学中的用途。

主权项：1.融合蛋白，其从N端到C端包含：a目标多肽，其中所述目标多肽是免疫原性的，b跨膜结构域，其包含i如下的跨膜结构域：包含SEQIDNO：16的氨基酸序列的HIVgp41多肽，包含SEQIDNO：17的氨基酸序列的人CD22分子，包含SEQIDNO：18的氨基酸序列的人CD36分子，或包含SEQIDNO：19的氨基酸序列的人CD44分子；ii包含SEQIDNO：30的氨基酸序列的HIV-1Env的R696A突变体，或iii相对于i和ii的跨膜结构域具有至少80％、90％或95％序列同一性并且基本上保持其嵌入至质膜的能力的i和ii的功能等同变体，和c包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HIVgag多肽，或与所述HIVgag多肽具有至少80％、90％或95％序列同一性并且基本上保持其病毒样颗粒形成活性的其功能等同变体。

全文数据：用于诱导抗体表达的具有高密度包衣的病毒样颗粒技术领域本发明涉及用于人类医学和兽医学的融合蛋白和病毒样颗粒VLP。本发明还涉及包含目标多肽、跨膜结构域和HIVgag多肽及它们的功能等同变体的融合蛋白。本发明另外涉及表达或呈递所述融合蛋白的多核苷酸、载体、宿主细胞和VLP颗粒，以及涉及包含所述融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞和VLP的药物组合物、免疫原性组合物或疫苗组合物及其在治疗和预防传染性疾病和癌症中的用途。背景技术病毒样颗粒VLP代表了已被证明抵抗无包膜病毒如乙型肝炎病毒HBV、人乳头状瘤病毒HPV或戊型肝炎病毒HEV有效的优异疫苗平台。参见LuaL等，Biotechnol.Bioeng.2014；111:425-440。在这些情况下，VLP包含在原核或真核细胞系统中生成以自发地形成具有优异免疫原性结果的VLP的单一衣壳蛋白。VLP生成平台的成功和多功能性促进了对更加复杂的设计的探索。一些实例可以是通过在病毒衣壳蛋白中植入外源序列产生具有异源抗原呈递的VLP和产生包含源自VLP生成VLP-producer细胞的脂双层并显示异质性高于无包膜VLP的包膜VLP。参见BryantM等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1990；87:523-527和ViscianoM等，Vaccine2011；2931:4903-4912。人类免疫缺陷病毒HIV疫苗研究也已使用涉及，approachedVLP技术。对于其它逆转录病毒，HIV颗粒是有包膜的结构，该结构通过在感染细胞质膜的内部分上通过豆蔻酰化myrystoylation其N-末端使Gag结构蛋白多聚化而形成。参见上文Bryant,1990。在芽生budding过程中，Gag聚合物并入基因组病毒RNA、不同病毒酶和辅助蛋白并征集recruit细胞表面表达的包膜糖蛋白复合体以确保感染性。然而，众所周知逆转录病毒的gag基因的表达足以生成缺少感染性的VLP结构。参见上文Visciano,2011和CerveraL等，J.Biotechnol.2013；166:152-165。这些裸GagVLP可被修饰以并入蛋白质或RNA和充当递送载体或者在其表面上并入蛋白质以充当疫苗制剂。参见上文Visciano,2011。在过去几年中，若干组已开发了专注于HIV疫苗研究的有包膜VLP的生成方法。参见上文Visciano,2011和Cervera,2013。然而，有包膜VLP的最佳产生不是这些途径方法，approaches中的唯一障碍。第二主要困难在于HIV包膜糖蛋白Env的复杂性。参见MaoY等，Nat.Struct.Mol.Biol.2012；19:893-899。这种大的糖蛋白包含能够产生中和与非中和抗体的两种亚基gp120和gp41。尽管重新设计充当免疫原以诱发针对Env的中和抗体的蛋白质模拟物的途径有多种，但是取得了很少的阳性结果。参见上文Mao,2012。然而，尽管迄今为止作出了努力，但是本领域对于在VLP化合物中导入抗原表位的新型方式以及开发用于诱发针对具体抗原表位的免疫应答的VLP仍存在持续需求。发明内容在第一方面，本发明涉及融合蛋白，其从N端至C端包含以下：a目标多肽，或其功能等同变体，b跨膜结构域，或其功能等同变体，和cHIVgag多肽，或其功能等同变体。在另外的方面，本发明涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。在进一步的方面，本发明涉及包含根据本发明的多核苷酸的载体。在另一方面，本发明涉及包含根据本发明的融合蛋白或载体的宿主细胞。在再进一步的方面，本发明涉及用于制备装载有免疫原性多肽的VLP的方法，其包括：a在细胞中表达根据本发明的融合蛋白，和b从胞外培养基回收VLP。另外，本发明涉及包含根据本发明的融合蛋白或通过利用本发明的方法获得的融合蛋白的病毒样颗粒。在进一步的方面，本发明涉及包含根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或病毒样颗粒、或其组合的药物组合物。在另一方面，本发明涉及用于医学的根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合。在再进一步的方面，本发明涉及用于治疗或预防受试者中由感染或肿瘤引起的疾病的根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合。在该方面的可选形式中，本发明涉及治疗或预防受试者中由感染或肿瘤引起的疾病的方法，所述方法包括向受试者给予治疗有效量的根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合。在该方面的进一步可选形式中，本发明涉及根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合在制备用于治疗或预防受试者中由感染或肿瘤引起的疾病的药物中的用途。另外，本发明涉及包含根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合的试剂盒kit。附图说明图1.用于免疫原性试验的不同蛋白质和VLP制剂。包括gp41糖蛋白的HR2、MPER和TM区的gp41衍生的蛋白质MIN在大肠杆菌中表达，6×His标签包含在设计中处于蛋白质的C端用于纯化。通过在HEK-293T细胞中转染编码HIV-1gag的质粒产生裸VLP。这些裸VLP使来自生产细胞膜的人蛋白质VLP表面上的浅灰色元件暴露。可选地，通过将相同的gag表达质粒与编码包含gp41的完整胞质尾的MIN蛋白的质粒共转染生成MIN-VLP。MIN蛋白被并入VLP表面上。通过表达缺少融合至gag序列的胞质尾在残基2处起始的MIN蛋白的变体生成最终的VLP制剂。形成的VLP预期在其表面上展现高密度MPER表位化学计量学1:1的gag:gp41。图2.通过共转染获得的可溶性MIN和MIN-VLP的表征和免疫原性。A可溶性MIN蛋白在大肠杆菌中表达并通过Ni2+亲和色谱和凝胶过滤色谱纯化至均一。最终的制剂包含单一的17kDa的带。分子量标记显示在左侧。B在C57BL6小鼠中测试可溶性MIN制剂的免疫原性。显示了针对MIN蛋白对于来自对照动物或在磷酸铝存在或不存在的情况下用MIN50μg剂量免疫的动物的血清1100稀释的ELISA数据。C稳定转染以表达Env糖蛋白NL4.3分离物，克隆K右、GAG克隆G1F2、MIN克隆，4.2E6或Gag和MIN两者左，克隆4G2A的HEK-293T细胞针对MPER表位的细胞表面表达和针对CA-p24蛋白Gag的胞内表达被染色。包括未转染的HEK-293T细胞作为阴性对照。显示了流式细胞术分析。D通过利用抗p24抗体上方和抗MPER抗体2F5下方的WB分析来自HEK-293TG1F2细胞表达Gag和HEK-293T4G2A细胞共同表达Gag和MIN两者的细胞团块和上清液。E作为平行，在C57BL6小鼠中测试MIN-VLP制剂的免疫原性。显示了针对MIN蛋白对于来自对照动物或在磷酸铝存在或不存在的情况下用MINVLP50μg总蛋白剂量免疫的动物的血清1100稀释的ELISA数据。图3.MINGAGVLP的表征。A用编码MINGAG融合蛋白的质粒pcDNA3.lMINGAG-3.7、编码全长gag的质粒pcDNA3.lGAG或用空的pcDNA3.l质粒转染HEK-293T细胞。24小时后，将细胞用抗MPER抗体2F5顶部或10E8底部进行细胞表面染色和用抗p24抗体Kc57进行胞内染色。Gag和MPER抗原两者的共同表达在两种情况下都被清楚地观察。B收集来自转染细胞的上清液并通过使用多克隆抗Gag抗体左和抗MPER抗体2F5右的蛋白质印迹进行测定。显示分子量标记用于参考。C还将上清液在通过300kDa分子截留cutoff装置过滤之前和之后测定总的p24含量。数值代表总的p24含量相对于图的直径，显示了颗粒的部分VLP相关的，浅灰色和可过滤的自由的，深灰色材料。D利用Nanosight测定上清液的粒径。裸VLP顶部或MINGAGVLP底部的制剂分别测定三次或四次，显示了相当的结果。每一条线对应单独的测定。图4.小鼠中的MINGAGVLP免疫原性。A在佐剂磷酸铝+ADJ存在或不存在的情况下用裸VLP或MINGAGVLP免疫的小鼠中抗MINIgG的时间进程。B在佐剂磷酸铝存在或不存在的情况下在处死用裸VLP或MINGAGVLP免疫的小鼠后抗GagIgG的量级。C电子显微镜学分析用于免疫的未处理的顶部VLP和磷酸铝处理的底部VLP。D在TZM-b1细胞中测定来自被处死动物的血清1100稀释和纯化的IgG100μgmL抵抗所示出病毒的中和活性。显示了在个体动物血清或IgG的存在下NL43和BaL的感染性。图5.小鼠中的肽VLP免疫。A用四剂量KLH-MPER和四剂量MINGAGVLP免疫或用对照KLH和裸VLP免疫的小鼠中抗MINIgG的时间进程。B被免疫小鼠中抗MINIgG应答的图谱。数据显示获自个体动物的血清对包含方法中所述的gp41的HR2和MPER序列的一组15mers重叠肽的反应性。C在TZM-b1细胞中测定来自被处死动物的血清1100稀释抵抗所示出病毒的中和活性。显示了在个体动物血清的存在下的病毒感染性。星号表示统计显著性。图6.兔中的MINGAGVLP免疫。A用两剂量裸VLP或MINGAGVLP免疫的兔中抗T-20和抗C34IgG的时间进程。B被免疫兔中抗MINIgG应答的图谱。数据显示获自被免疫动物的血清样本对包含方法中所述的gp41的HR2和MPER序列的一组15mers重叠肽的反应性。C在TZM-bl细胞中测定来自被处死动物的纯化IgG100μgmL和IgG耗尽的depleted血清抵抗所示出病毒的中和活性。显示了在个体动物IgG的存在下的病毒感染性。星号表示统计显著性。图7.密码子优化对VLP表达的影响。用空质粒上左、GAG表达质粒野生型，上右、MINGAG质粒3.7非优化的，下左和密码子优化版的MINGAG下右转染的HEK-293T细胞的典型点状图。在用抗MPER抗体2F5和抗GAG抗体Kc57胞内染色转染后24h对细胞染色。密码子优化显著地提高了MPER和GAG表达。图8.用编码自包装VLP的DNA免疫小鼠诱导抗Gag和抗gp41体液应答。用四剂量裸DNA利用空的、编码GAG的和编码MINGAG的pVAX1载体免疫的小鼠中抗GAG上图和抗MIN下图IgG应答的时间进程。图9.位于MIN和GAG之间的不同接头对VLP抗原性和生成的影响。在HEK-293T细胞中表达具有G4S、不具有接头或具有AEAAAKA或APAPAPA接头的MINGAG融合蛋白。A转染后48h，用所示出的抗MPER抗体2F5、10E8和4E10和用抗GAG抗体Kc57对细胞染色。GAG+事件当中MPER+细胞的百分数显示为表位暴露的测量。B通过ELISA测量转染细胞的上清液中VLP的生成并标准化为MINGAGG4S构建物。图10.位于胞外gp41序列和GAG之间的不同TM序列对VLP抗原性和生成的影响。在HEK-293T细胞中表达具有野生型gp41TM、人CD22TM、人CD36TM、人CD44TM或R696A突变的gp41TM的MINGAG融合蛋白。A转染后48h，用所示出的抗MPER抗体2F5、10E8和4E10和用抗GAG抗体Kc57对细胞染色。GAG+事件当中MPER+细胞的百分数显示为表位暴露的测量。B通过ELISA测量转染细胞的上清液中VLP的生成并标准化为MINGAG野生型TM构建物。图11.移入VLP表面上的短表位的表达。在HEK-293T细胞中表达其中已由HCV中和表位替换2F5表位的MINGAG融合蛋白。A融合蛋白的图示Scheme。B转染后48h，用所示出的抗MPER抗体2F5、10E8和4E10或抗HCV抗体AP33结合抗GAG抗体Kc57对细胞染色。显示了流式细胞术点状图。C通过ELISA测量转染细胞的上清液中VLP的生成并标准化为MINGAG构建物。图12.VLP表面上大抗原的表达。在HEK-293T细胞中表达其中已由不同抗原替换胞外gp41序列的MINGAG融合蛋白。A融合蛋白的图示。B转染后48h，用所示出的抗体结合抗GAG抗体Kc57对细胞染色。显示了流式细胞术点状图。C通过ELISA测量转染细胞的上清液中VLP的生成并标准化为MINGAG构建物。微生物保藏质粒pcDNA3.lMINGAG-3.7于2012年7月25日以登录号DSM26214保藏于德意志联邦共和国的DSMZ–三姆隆·冯·米克罗根曼和泽尔克图伦DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，Inhoffenstraβe7B，D-38124布伦瑞克Braunschweig。序列表显示了所附序列表中使用标准字母缩写和本领域常规使用的编码描述的核酸和氨基酸序列。虽然仅显示每个核酸序列的一条链，但是应当理解通过对所展示链的任何引用来包括互补链。所附序列表是本发明不可分割的部分。具体实施方式抗体产生的主要限制之一是目标抗原体外并入VLP较差。本发明描述了使用基于gp41的蛋白质和其它蛋白质的新型VLP，所述新型VLP包括用于克服该限制的融合至gag的跨膜结构域。本发明中公开了这种设计：i允许这些蛋白质的膜定位,ii维持Gag的VLP自包装能力，iii显示增加的gp4l表面密度和iv改善抗原的正确的空间呈递，因而v增强对所述抗原的免疫原性应答。结果清楚地表明了本发明的VLP的提高的免疫原性。1.通用术语和表达的定义如本文使用的术语“AIDS”指代HIV感染的症状期和包括获得性免疫缺陷综合征通常被称为AIDS和“ARC”或AIDS相关的复合体两者。参见AdlerM等，Brit.Med.J.1987；294:1145-1147。AIDS的免疫学表现和临床表现是本领域公知的，并且包括例如免疫缺陷导致的机会性感染和癌症。如本文使用的术语“变应原”指代受试者对其敏感并可引起免疫反应的肽、多肽或蛋白质例如花粉、昆虫、食物或食物产品的变应原提取物；唾液、昆虫爪或刺中存在的组分；植物组分。如本文使用的术语“氨基酸”指代天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。在本文中可通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会BiochemicalNomenclatureCommission推荐的单字母符号来指代氨基酸。同样地，可通过其通常接受的单字母编码来指代核苷酸。如本文使用的术语“密码子优化的”指代核酸中密码子的改变以反映宿主有机体的一般性密码子使用从而在不改变其氨基酸序列的情况下提高参考多肽的表达。存在本领域已知的用于密码子优化的若干方法和软件工具。参见NarumD等，Infect.Immun.2001；6912:7250-7253,OutchkourovN等，ProteinExpr.Purif.2002；241:18-24,FengL等，Biochemistry2000；3950:15399-15409和HumphreysD等，ProteinExpr.Purif.2000；202:252-264。如本文使用的术语“包含包括，comprising”或“包含包括，comprises”还公开了根据通常接受的专利实践的“由……组成”。如本文使用的术语“Env”或“gp160”指代具有HIV的外包膜蛋白质Env的抗原特异性或生物学功能并包含两种亚基——gp120和gp41糖蛋白——的糖蛋白。可获得野生型wtgp160多肽的示例性序列。参见GenBank登陆号AAB05604和AAD12142。如本文使用的术语“表位”指代本领域已知的任何方法确定的给定免疫原性物质的那一部分，其是设置有具备了，mounted针对所述免疫原性物质免疫应答的受试者的免疫系统的抗体或细胞-表面受体的靶标即,被抗体或细胞-表面受体结合。进一步地，表位可被定义为本领域可获得的任何方法确定的被受试者中体液应答或细胞应答——并且具体地抗体应答或T细胞应答——识别的免疫原性物质的一部分。表位可以是任何免疫原性物质——如蛋白质、多核苷酸、多糖、有机或无机化学品或其任意组合——的一部分。术语“表位”也可与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换使用。如本文使用的术语“表达express”、“表达expresses”或“表达expression”指代核酸分子的转录，和任选地其翻译。一般地，编码序列的转录和翻译将导致生成多肽，如本发明的融合蛋白。如本文使用的表述“功能等同变体”指代：i一个或多个氨基酸的修饰、缺失或插入导致的并且基本上保留其参考多肽的活性的多肽和ii一个或多个碱基的修饰、缺失或插入导致的并且基本上保持参考核酸所表达的多肽的活性的多核苷酸。本发明的上下文中考虑的功能等同变体包括这样的多肽：其显示与序列SEQIDNO：1-2、5、15-28、30、32、34、36和38至少60％、70％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％、99％的相似性或同一性并且就gag多肽变体而言保持基本上等同的诱导VLP形成的能力或就HIVgp41多肽的功能等同变体而言保持嵌入至质膜的能力。本发明的上下文中考虑的功能等同变体还包括这样的多核苷酸：其显示与序列SEQIDNO：3-4、6-14、29、31、33、35、37和40至少60％、70％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％、99％的相似性或同一性并且当被表达时就gag多肽变体而言保持基本上等同的诱导VLP形成的能力或就HIVgp41多肽的功能等同变体而言保持嵌入至质膜的能力。两个多肽或两个多核苷酸之间的同一性或相似性的程度通过使用本领域广泛已知的计算机执行的算法和方法确定。两个氨基酸序列之间的同一性和相似性优选地使用BLASTP算法确定。参见AltschulS等，“BLASTManual”NCBINLMNIH,Bethesda,MD,USA,2001。如本文使用的术语“融合蛋白”涉及通过基因技术产生的蛋白质，其由源自不同蛋白质的两个或更多个功能结构域构成。融合蛋白可通过常规手段例如利用编码所述融合蛋白的核苷酸序列在适合的细胞中进行基因表达获得。如本文使用的术语“gag多肽”涉及HIV的gag基因的初级蛋白质产物，其提供病毒的基本的物理基础结构，并且其在成熟为MA基质蛋白，p17、CA衣壳蛋白，p24、SP1间隔肽1，p2、NC核衣壳蛋白，p7、SP2间隔肽2，p1和P6蛋白期间由病毒蛋白酶加工。如本文使用的术语“gp41”指代人类免疫缺陷病毒-1包膜糖蛋白gp41。Gp41是与gp120一起形成HIV-1的Env糖蛋白的亚基。Env是由三个外部亚基gp120和三个跨膜亚基gp41组成的三聚体。gp41蛋白的胞外部分包含三个主要功能区：融合肽FP、N端七残基重复序列heptadrepeatHR1和C端七残基重复序列HR2。HR1和HR2区包含若干亮氨酸拉链样基序，其具有形成卷曲结构的趋势。参见PeisajovichS,ShaiY,Biochem.Biophys.Acta2003；1614:122-129；SuárezT等，FEBSLett.2000；477:145-149；ChanD等，Cell1997；89:263-273。公众很容易地获得大量HIVgp-41的核酸和氨基酸序列。参见HIV序列数据库，http:www.hiv.lanl.govcontentsequenceHIVmainpage.html,July2017。如本文使用的术语“gp120”指代具有HIV的外包膜蛋白质env的抗原特异性或生物学功能的糖蛋白。“gp120蛋白”是源自Env多肽的gp120区的分子。gp120的氨基酸序列大约为511个氨基酸。Gp120是具有120kDa的表观分子量的大量N-糖基化的蛋白质。Gpl20包含散布有interspersedwith五个可变结构域Vl-V5的五个相对保守的结构域C1-C5。可变结构域包含大量的氨基酸替换、插入和缺失。“gpl20多肽”包括单一亚基和多聚体两者。gp41部分锚点在和跨越病毒体的膜双层中，而gpl20区段突出到周围环境中。gp120的受体结合结构域定位至蛋白质的N端半部。这随后是富含脯氨酸区PRR——其作为铰链或触发器运作以传达受体结合至融合机构machinery。gp120的C端是高度保守的并且与gp41相互作用。参见GenBank登录号AAB05604和AAD12142。如本文使用的术语“七残基重复序列heptadrepeat2”或“HR2”指代，但不限于，位于野生型gp41的胞外部分的羧基端的七残基重复序列区。参见EgginkD等，J.Virol.2008；8213:6678-6688。七残基重复序列是这样的基序：其中每七个残基就重复一个疏水氨基酸。这种基序被命名throughg。参见LupasA,TrendsBiochem.Sci.1996；21:375-382。在a和d位置处包含疏水或中性残基的七残基重复序列可形成α螺旋并且能够通过形成卷曲螺旋与其它七残基重复序列相互作用。参见上文ChambersP等，J.Gen.Virol.1990；71:3075-3080和Lupas,1996。如本文使用的术语“HIV”包括HIV-1和HIV-2、SHIV和SIV。“HIV-1”意为人类免疫缺陷病毒1型。HIV-1包括，但不限于，胞外病毒颗粒和与HIV-1感染的细胞相关的HIV-1的形式。HIV-1病毒可代表任何已知的主要亚型A、B、C、D、E、F、G和H类或包括实验室毒株strain和初级分离物的无关外围、次要，outlying亚型O组。“HIV-2”意为人类免疫缺陷病毒2型。HIV-1种属包括，但不限于，HIV-1JR-FL、HIV-1DH123、HIV-1Gun-1、HIV-189.6和HIV-1HXB2毒株。HIV-2包括，但不限于，胞外病毒颗粒和与HIV-2感染的细胞相关的HIV-2的形式。术语“SIV”指代猿猴免疫缺陷病毒，其是传染猴子、黑猩猩和其它非人灵长类动物的类HIV病毒。SIV包括，但不限于，胞外病毒颗粒和与SIV感染的细胞相关的SIV的形式。如本文使用的术语“HIV暴露”指代未感染的受试者与具有HIV感染或AIDS的受试者接触，或与来自这种感染HIV的受试者的体液接触——其中来自感染的受试者的这种流体以这样一种方式接触未感染的受试者的组织中的黏膜、伤口或擦伤例如针棒、无保护性交、或其它表面：病毒可从感染的受试者或感染的受试者的体液传递到未感染的受试者。如本文使用的术语“HIV感染”指代个体中HIV病毒存在的指示适应症，indication，包括无症状的血清阳性、AIDS相关的复合体ARC和获得性免疫缺陷综合征AIDS。如本文使用的术语“HIV-1JR-FL”指代最初从取自尸体解剖的AIDS患者的脑组织分离并与凝集素活化的正常人PBMC共培养的HIV-1毒株。如可在本文互换使用的术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”指代根据本发明的核酸或载体所导入的细胞。“宿主细胞”和“重组宿主细胞”还包括这种细胞的后代或潜在的后代。因为在随后产生中可发生由于突变或环境影响造成的某些修饰，所以这种后代实际上可能不同于亲本细胞，但仍可包括在如本文使用的术语的范围内。在两个或更多个核酸或多肽的情境中，术语“同一的”或百分数“同一性”指代当两个或更多个序列或子序列进行比较和比对如有必要则引入间隙差异，gaps时，所述序列或子序列是相同的或具有特定百分数的相同核苷酸或氨基酸残基，为了最大对应性，不考虑任何保守的氨基酸替换作为序列同一性的部分。同一性的百分数可使用序列比较软件或算法或通过目测来测量。各种算法和软件是本领域已知的，可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对。适用于确定序列相似性的算法的实例包括，但不限于，BLAST、GappedBLAST、和BLAST2.0、WU-BLAST-2、ALIGN和ALIGN-2算法。参见AltschulS等，Nuc.AcidsRes.1977；25:3389-3402,AltschulS等，J.Mol.Biol.1990；215:403-410,AltschulS等，Meth.Enzymol.1996；266:460-480,KarlinS等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1990；87:2264-2268,KarlinS等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1993；90:5873-5877,GenentechCorp,SouthSanFrancisco,CA,US,https:blast.ncbi.nlm.nih.govBlast.cgi,2017年7月。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。可例如通过以下来执行用于比较的最佳序列比对：通过Smith-Waterman局部同源算法、通过Needleman-Wunsch同源比对算法、通过Pearson-Lipman相似性研究方法、通过计算机化执行这些算法或通过手动比对和目测。参见SmithT等，Adv.Appl.Math.1981；2:482-489,NeedlemanS等，J.Mol.Biol.1970；48:443-453,PearsonW等，LipmanD,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1988；85:2444-2448,GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA程序、Wisconsin遗传学软件包、遗传学计算机组GeneticsComputerGroup、Madison,WI,USA；AusubelF等，Eds.,“ShortProtocolsinMolecularBiology”,第五版。JohnWiley和Sons,Inc.,NewYork,NY,USA,2002。如本文使用的术语“免疫原性组合物”指代能够在受试者中诱发针对特异免疫原的体液例如抗体免疫应答或细胞例如细胞毒性T细胞免疫应答的药物组合物。如本文使用的术语“免疫原性多肽”涉及来自致病性有机体、肿瘤标记物或变应原的多肽，当其被给予受试者时可诱导针对有机体、肿瘤标记物或变应原的保护性免疫应答。如本文使用的术语“免疫学上功能等同物”指代保持与参考多肽基本上等同的在受试者中诱导免疫应答的能力的多肽的变体。术语“免疫学上功能等同物”是本领域公知的并且在本文被进一步详细限定。免疫学上功能等同物可提高多肽的抗原性、维持参考多肽的抗原性的相同水平、或仅略微降低多肽的抗原性使得其维持其在免疫原性组合物中作为抗原的有用性。如本文使用的术语“传染病”涉及由病原体如病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生虫引起的疾病。如本文使用的术语“试剂盒kit，套组”指代包含实施根据本发明的用途和方法所必需的不同试剂的产品，其被包装以允许其运输和储存。适用于包装试剂盒组分的材料包括晶体、塑料例如聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、瓶子、小瓶、纸或信封。如本文使用的术语“KLH”涉及发现于大型钥孔戚keyholelimpet——大锁孔帽贝Megathuracrenulata，钥孔戚的一种，生活在Monterey海湾到下加利福尼亚附近off的IslaAsunción的加利福尼亚海岸——的血淋巴中的大的、多亚基、携氧、金属蛋白。如本文使用的术语“接头区”或“接头”指代长度上至少1、2、3、4或5或更多个氨基酸的任何异源多肽，其在被插入于第一区和第二区之间时产生功能联接linkage——连接两个区并且其中每个区都可保留其功能特性和免疫学特性。如本文使用的术语“膜近测外部区”或“MPER”指代，但不限于，邻近病毒膜的gp41胞外结构域的高度保守区。如本文使用的术语“中和抗体”或“nAb”是结合至胞外分子例如，在致病性病毒或细菌表面中的蛋白质或蛋白质结构域并干扰病原体感染细胞的能力或调节其活性的任何抗体或抗原-结合片段。在本发明的上下文中，病原体优选地是HIV，和更具体地，HIV病毒包膜的gp120蛋白。具体地，术语“HIV中和抗体”指代与gp120的CD4结合位点具有亲和性的中和抗体，如IgGb12。术语“中和抗体”包括bnAbs的亚类。如本文使用的，“广泛中和的抗体”或“bnAb”被理解为通过任何方法获得的抗体，其在以有效剂量递送时可用作用于预防或治疗HIV感染或AIDS、抵抗多于7种HIV毒株，优选地多于8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种HIV毒株的治疗剂。如本文使用的术语“NL4-3”和“BaL”指代常用于实验室中的两种不同的HIV分离物。NL4-3分离物克隆自NY5和LAV前病毒。参见AdachiA等，J.Virol.1986；59:284-291。BaL分离物获自从移植的肺组织生长的附着细胞的原代培养物。参见GartnerS等，Science1986；233:215-219。如可在本文互换使用的术语“核酸”、“多核苷酸”和“核苷酸序列”涉及任意长度的任意聚合形式的核苷酸并且由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成。术语包括单链和双链多核苷酸两者，以及被修饰的多核苷酸例如，被甲基化的、被保护的。一般地，核酸是“编码序列”，如本文使用的，其指代在宿主细胞中当置于适当调控序列的控制下被转录和翻译成多肽的DNA序列。编码序列的边界由5'氨基端的起始密码子和3'羧基端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括，但不限于，原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核例如，哺乳动物的DNA的基因组DNA序列和甚至合成的DNA序列。转录终止序列通常会位于编码序列的3'。如本文使用的术语“可操作地连接的”意为目标核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式连接到调控序列一个或多个例如在体外转录翻译系统中或当载体导入宿主细胞时在宿主细胞中。参见AuerH,NatureBiotechnol.2006；24:41-43。如本文使用的表述“肠胃外给予”和“肠胃外地给予”意为除了肠给予和局部给予之外的给予模式，通常通过注射，并且不限制地包括静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮肤内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、和胸骨内注射和输注。如本文使用的表达“外周血单核的细胞”或其缩写“PBMC”指代具有圆形核的任何外周血细胞。这些细胞由淋巴细胞即T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞组成。如本文使用的表达“药学上可接受的载体”包括生理学上可与根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或VLP相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂。如本文使用的术语“药物组合物”指代根据本发明的至少一种融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或VLP与至少一种其它成分的组合，所述其它成分包括但不限于药学上可接受的载体，其赋予了适用于向受试者给予的组合。术语“药物组合物”包括，但不限于，免疫原性和疫苗组合物。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物，所述聚合物可包含多于一个氨基酸残基例如二肽、三肽、寡肽。术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。如本文使用的术语“预防prevent”、“预防preventing”和“预防prevention”指代抑制受试者中疾病的起始或减少疾病的发生。预防可以是完全的例如在受试者中完全不存在病理学细胞。预防也可以是部分的，如，例如，降低受试者中病理学细胞的发生。预防还指代对临床状况减少的易感性。在本发明的上下文中，术语“预防prevent”、“预防preventing”和“预防prevention”具体指代避免或减少持续HIV暴露的受试者中HIV感染的可能性。如本文使用的表达术语“Env蛋白的加工导致的产物”指代通过gp160蛋白的加工所生成的任何蛋白质。如本文使用的术语“重组细菌”指代通过导入异源DNA修饰的任何细菌。“野生型”细菌或“对照”细菌包括这样的细菌：以其自然状态被发现而无基因操作或基本上与重组细菌相同但不表达由异源DNA编码的一种或多种蛋白质例如包含无异源目标多肽的编码序列的质粒。术语意图包括通过导入异源DNA最初修饰的细菌的后代。如本文使用的表达“严格的杂交条件”指代这样的条件：在所述条件下，一般在核酸的复杂混合物中探针将与其靶子序列杂交但不与其它序列杂交。如本文使用的术语“受试者”指代个体植物或动物，如人、非人灵长类动物例如黑猩猩和其它猿和猴种类；农场动物farmanimals，如鸟、鱼、兔子、山羊、绵羊、猪、牛和马；伴侣动物，如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠。术语不指示具体的年龄或性别。术语“受试者”包括胚胎和胎儿。在优选实施方式中，受试者是人。如本文使用的术语“基本上等同的”指代这样的变体：所述变体能够产生的免疫应答不同于用以不多于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的天然区nativeregion产生的免疫应答。如本文使用的术语“治疗剂”指代用于治疗或预防疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括，但不限于、表位、抗原、免疫原、抗体、抗体片段、药物、细胞毒素剂、促凋亡剂pro-apopoptoticagents、毒素、核酸酶例如DNA酶和RNA酶、激素、免疫调节剂、螯合剂、光敏剂或染料、抗血管生成剂、化疗剂、细胞因子、趋化因子、前药、酶、结合蛋白、肽或其组合。如本文使用的术语“治疗有效量”指代在受试者中产生治疗应答或期望效果的根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、VLP、药物组合物或免疫原性组合物或疫苗组合物、或其组合的剂量或量。如本文使用的术语“跨膜结构域”和“TM结构域”指代大致疏水的残基的氨基酸序列，所述大致疏水的残基具有穿过膜的整合蛋白的偶尔具有极性的残基。如本文使用的表述“HIVgp41多肽的跨膜结构域”指代这样的gp41多肽的区域，一旦gp41获得其天然拓扑学就被嵌入质膜。如本文使用的术语“治疗treat”和“治疗treatment”指代给予根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、VLP、药物组合物、免疫原性组合物或疫苗组合物、或其组合，以在疾病的临床症状已经出现后控制疾病的进展。疾病进展的控制被理解成意指有益或期望的临床结果，包括，但不限于，症状的减少、疾病持续时间的减少、病理学状态的稳定具体地，避免另外的恶化、延迟疾病的进展、改善病理学状态和缓解部分和全部。疾病进展的控制还涉及存活的延长——相比于如果不施加治疗而预期的存活。在本发明的上下文内，术语“治疗treat”和“治疗treatment”具体指代停止或减缓HIV感染的受试者中健康的CD4+T细胞的感染和破坏。其还指代停止和减缓获得性免疫缺陷疾病如极低的CD4+T细胞计数和机会性病原体重复感染的症状的发生。有益或期望的临床结果包括，但不限于，绝对幼稚CD4+T细胞计数范围10-3520的增加、相对于总的循环免疫细胞CD4+T细胞百分数的增加范围1-50％、或作为未感染的受试者中正常CD4+T细胞计数的百分数的CD4+T细胞计数的增加范围1-161％。“治疗Treatment”还可意为感染的受试者存活的延长——相比于如果受试者不接受任何靶向HIV的治疗而预期的存活。如本文使用的术语“疫苗”和“疫苗组合物”指代用于体内给予受试者以赋予保护免于疾病和具体地细菌性或病毒疾病的免疫原性组合物。如本文使用的术语“载体”指代核酸分子，线性或环状的，其包含可操作地连接至在宿主细胞中提供核酸自主复制的另外片段的根据本发明的核酸或根据核酸分子的表达盒的核酸。如本文使用的术语“病毒样颗粒载体”和“VLP”指代不包含任何病毒遗传材料的类似于病毒的非传染性颗粒。VLP是病毒结构蛋白如衣壳蛋白的表达及其自组装的结果。2.融合蛋白在第一方面中，本发明涉及融合蛋白，其从N端至C端包含以下：a目标多肽，或其功能等同变体，b跨膜结构域，或其功能等同变体，和cHIVgag多肽，或其功能等同变体。在优选实施方式中，目标多肽包含治疗剂、治疗剂区域、或其功能等同变体。治疗剂的实例包括，但不限于，表位、抗原、免疫原、抗体、抗体片段、药物、细胞毒素剂、促凋亡剂、毒素、核酸酶例如DNA酶和RNA酶、激素、免疫调节剂、螯合剂、光敏剂光活性剂，photoactiveagent或染料、抗血管发生剂、化疗剂、细胞因子、趋化因子、前药、酶、结合蛋白、肽、或其区域。优选地，治疗剂是表位、抗原、免疫原、或其功能等同变体。在另一实施方式中，目标多肽包括一种或多种治疗剂、其区域或功能等同变体的组合。这些组合的实例包括，但不限于，包含不同来源例如病毒抗原细菌性抗原、肿瘤标记物细菌性抗原或相同来源例如相同病原体的两种或更多种抗原的两种或更多种治疗剂的目标多肽。优选地，HIVgag多肽或其功能等同变体来自HIV-lHXB2。来自HXB2的gag多肽的全序列在UniProt数据库2016年7月6日中具有登录号P04585-l并且包含序列SEQIDNO：1。优选地，HIVgag多肽的功能等同变体显示其参考多肽的形成活性的至少60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％。存在本领域已知的若干技术，用于评价根据本发明的VLP的功能等同变体的形成活性。因此，HIVgag多肽的功能等同变体显示关于对应天然HIVgag多肽的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的相似性程度，条件是维持蛋白质的VLP形成能力。优选地，相似性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域，或更优选地长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域。如下所述，两个核酸序列或多肽基本上是相同的指示在于第一核酸所编码的多肽免疫学上与针对第二核酸所编码的多肽引起产生，raised的抗体交叉反应。因此，多肽一般被认为基本上与第二多肽相同，例如，当两个肽仅因保守替换而不同时。两个肽之间的相似性程度可使用本领域技术人员公知的计算机算法和方法确定。两个肽的两个氨基酸序列之间的同一性优选地使用BLASTP算法确定。参见Altschul,S.等，“BLASTManual”,NCBINLMNIHBethesda,Md.20894,AltschulS等，J.,1990,Mol.Biol.215:403-410。在优选实施方式中，关于gag的功能等同变体的同一性程度根据变体的完全序列、gag的完全序列或两者的完全序列确定。在优选实施方式中，HIVgag多肽或其功能等同变体缺少豆蔻酰化序列。豆蔻酰化是一种脂化修饰，其中源自豆蔻酸的豆蔻酰基团被酰胺键共价连接至N端甘氨酸残基的α氨基基团。在HIVgag多肽中，容易被豆蔻酰化的甘氨酸是SEQIDNO：1的位置2中的甘氨酸。第一甲硫氨酸被宿主细胞机构移除。优选地，缺少豆蔻酰化序列的HIVgag的功能等同变体包含序列EQIDNO：2。任何单向单程，single-pass跨膜蛋白可用于本发明中。实例包括，但不限于，CD22SEQIDNO：18的跨膜结构域、CD36SEQIDNO：19的跨膜结构域、CD44SEQIDNO：20的跨膜结构域和HIV-1EnvSEQIDNO：31的R696A突变体的跨膜结构域。序列形成跨膜结构域的能力可通过本领域已知的各种试验来分析。在优选实施方式中，跨膜结构域是HIVgp41多肽或其功能等同变体的跨膜结构域。在具体实施方式中，HIVgp41多肽的跨膜区包含序列SEQIDNO：17。根据本发明的融合蛋白包含位于HIVgag多肽N端的免疫原性多肽或功能等同变体。免疫显性多肽可包含一个或多个表位。通常，但并不总是，这种免疫显性多肽或表位当根据本领域技术人员已知的方法测试时具有高免疫原性。能够诱导免疫应答的蛋白质或肽可以是重组蛋白质或肽，与具体微生物的天然抗原相同或类似。在优选实施方式中，目标多肽包含免疫原性多肽。优选地，免疫原性多肽是能够适于或被设计以在受试者中诱导针对传染性疾病如由致病性微生物例如病毒、细菌、真菌、支原体、体内和体外寄生虫引起的疾病的免疫应答的多肽。优选地，受试者是人类、伴侣或农场动物。更优选地，受试者是人。病毒性病原体包括，但不限于，RNA病毒；DNA病毒；腺病毒科adenovirdiae例如乳腺病毒、禽腺病毒属；疱疹病毒科例如单纯性疱疹病毒1、单纯性疱疹病毒2、单纯性疱疹病毒5、单纯性疱疹病毒6；光滑病毒科例如光滑病毒、MS2阶段phase肠细菌、allolevirus；痘病毒科poxyiridae例如脊椎动物痘病毒亚科、副痘病毒、禽痘病毒属、山羊痘病毒属、兔痘病毒属、猪痘病毒属、molluscipox病毒、昆虫痘病毒亚科entomopoxyirinae；乳多空病毒科例如多瘤病毒、乳头状瘤病毒；副粘液病毒科例如副粘液病毒、副流感病毒1型、麻疹病毒属mobillivirus例如麻疹病毒、腮腺炎病毒属例如腮腺炎病毒；肺炎病毒科pneumonoviridae例如肺病毒属、人RSV；偏肺病毒metapneumovirus例如禽肺病毒、人偏肺病毒；小核糖核酸病毒科例如肠道病毒属、鼻病毒属、肝病毒属例如人甲型肝炎病毒、心脏病毒属、口疮病毒属；呼肠病毒科例如正呼肠病毒、环状病毒、轮状病毒、质型多角体病毒cypovirus、斐济病毒、植物呼肠病毒、水稻病毒；逆转录病毒科例如哺乳动物B型逆转录病毒、哺乳动物C型逆转录病毒、禽C型逆转录病毒、D型逆转录病毒群、BLV-HTLV逆转录病毒、慢病毒例如HIV-1、HIV-2、泡沫病毒；黄病毒科例如丙型肝炎病毒；肝DNA病毒科例如乙型肝炎病毒；披膜病毒科例如α病毒如辛德毕斯病毒和风疹病毒属如风疹病毒；弹状病毒科例如水泡性病毒、莱萨病毒、蜉蝣病毒、质型弹状病毒cytorhabdovirus、核型弹状病毒属necleorhabdovirus；沙粒病毒科例如沙粒病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、伊派病毒、拉沙病毒；和冠状病毒科例如冠状病毒、凸隆病毒torovirus；细胞巨化病毒单核细胞增多症；登革病毒登革热、休克综合征；爱泼斯坦-巴尔病毒单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤；人T-细胞嗜淋巴细胞病毒1型T-细胞白血病；甲型、乙型、和丙型流感呼吸疾病；日本脑炎病毒肺炎，脑病；脊髓灰质炎病毒麻痹；鼻病毒属普通感冒；风疹病毒胎儿畸形；牛痘病毒全身性感染；黄热病毒黄疸、肾衰竭和肝衰竭；和水痘带状疱疹病毒水痘。这些病毒性病原体的抗原的实例包括，乙型肝炎表面抗原、轮状病毒抗原如VP4和VP7、流感病毒抗原如血细胞凝集素或核蛋白和胸苷激酶单纯性疱疹抗原。病毒性病原体还包括能够产生HIV特异性免疫应答的HIV抗原。HIV抗原包括，但不限于，源自HIV早期调控蛋白的肽，包括HIVTat、Rev和Nef例如Nef-V3蛋白，或其它HIV蛋白如Gag、Pol、Env、Vif、Vpr和Vpu。具体地，这些蛋白质的肽表位是能够产生中和抗体的那些。众多HIVCTLCD8+和T辅助CD4+表位是本领域已知的和被考虑用于有效产生HIV特异性免疫应答的组合物中以及被考虑用于本发明的融合蛋白、VLP和药物组合物中。参见KorberB等，Eds.,“HIVMolecularImmunology”,LosAlamosNationalLaboratory,LosAlamos,NM,USA,20062007。兽医学上重要的具体病毒性病原体的实例包括，但不限于，古典猪瘟病毒Classicalswinefevervirus、PCV2断奶猪多系统衰弱综合征postwaeningmultisystemicwastingsyndrome和假狂犬病毒奥耶斯基病猪；BHV-1牛疱疹病毒1型牛；马流感病毒和WNV西尼罗河病毒马；禽流感病毒例如H5N1、HKN3、HTV土耳其疱疹病毒、MDV马立克病病毒和IBDV传染性囊疾病病毒和NVD新城疫病毒家禽；猫白血病病毒和兔病毒猫；和犬冠状病毒、犬瘟病毒、犬细小病毒和IHN病毒狗。细菌性病原体包括，但不限于，衣氏放线菌Actinornycesisraelli、炭疽杆菌、拟杆菌属、百日咳杆菌、伯氏疏螺旋体菌、布鲁氏菌属、弯曲杆菌属、空肠弯曲杆菌、衣原体属、沙眼衣原体、肉毒梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌、破伤风梭状芽孢杆菌、白喉棒状杆菌、肠球菌属、猪红斑丹毒丝菌、大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、具核梭杆菌、B型和非典型non-typable流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯杆菌、嗜肺性军团杆菌、钩端螺旋体属、单核细胞增多性李斯特菌、分枝杆菌属例如鸟分支杆菌M.avium、戈氏分支杆菌M.gordonae、胞内分支杆菌M.intracellubare、M.kansaii、麻风分支杆菌M.leprae、结核分枝杆菌M.tuberculosis、结核分枝杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、巴斯德菌属、出血败血性巴斯德菌、肺炎球菌属、铜绿假单胞菌、立克次氏体属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、链球菌属、链球菌厌氧种、链球菌草绿色型、无乳链球菌链球菌B型、链球菌B、牛链球菌、粪链球菌、念珠状链杆菌、突变链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、溶血性链球菌A型β、苍白密螺旋体、细弱密螺旋体、霍乱弧菌和鼠疫耶氏菌。兽医学上重要的具体细菌性病原体的实例包括，但不限于，胸膜肺炎放线杆菌和胞内劳森菌猪；中央无形原体、边缘无形原体、流产布氏菌、羊流产布氏杆菌和反刍类埃里希体牛；马链球菌马；流产嗜衣原体Chlamydophilaabortus绵羊；鸟博德特氏菌Bordetellaavium、鸡败血支原体、滑液支原体和沙门氏菌属家禽；杀鲑气单胞菌、鳗弧菌和红色耶尔森菌鱼；和咽喉卟啉单胞菌喉管卟啉单胞菌，Porphyromonasgulae、犬牙周卟啉单胞菌Porphyromonasdenticanis和唾液卟啉单胞菌狗。致病性真菌包括，但不限于，曲霉属、芽生菌属、假丝酵母属、球孢子菌属、隐球菌属、组织胞浆菌属、须霉属、体癣属、甲癣Tineaunguis属、申氏孢子丝菌属和卡氏肺囊虫属。致病性真菌的具体实例包括，但不限于，皮炎芽生菌、白色念珠菌、沙眼衣原体、粗球孢子属、新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌。致病性寄生虫包括，但不限于，恶丝虫属、利什曼原虫属、疟原虫属、裂体吸虫属、弓形体属和锥体虫Tripanosoma属。致病性寄生虫的具体实例包括，但不限于，犬恶丝虫、硕大利什曼原虫、杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、巴西利什曼原虫、巴拿马panamensis利什曼原虫、墨西哥利什曼原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、间日疟原虫、鼠弓形体、布氏锥体虫Tripanosomabrucei和克氏锥体虫Tripanosomacruzi。用于这些致病性寄生虫的具体抗原的实例包括疟原虫属环子孢子抗原、疟原虫属裂殖子表面抗原和利什曼原虫属gp63。兽医学上重要的具体致病性真菌和寄生虫的实例包括，但不限于，二联巴贝虫、牛巴贝虫、胎生网尾线虫Dictyocaulusviviparous、大片吸虫、肝片吸虫、犬新孢子虫Neosporacaninum、环状泰累尔梨浆虫、羊泰累尔梨浆虫和小泰累尔梨浆虫牛；神经肉孢子虫Sarcocystisneurona马；鼠弓形体绵羊；艾美球虫属球虫病、巨型艾美球虫Eimeriamaxima和柔嫩艾美球虫Eimeriatenella家禽；和犬巴贝虫、十二指肠贾第鞭毛虫Giardiaduodenalis和杜氏利什曼原虫狗。在另一优选实施方式中，免疫原性多肽是与能够适于或被设计以诱导或调节针对肿瘤或癌细胞的免疫应答的肿瘤或癌症“肿瘤标记物”相关的多肽。因此，根据本发明的融合蛋白可用于通过刺激针对肿瘤抗原的抗原特异性免疫应答来治疗或预防癌症。在人类癌症中超过一千种蛋白质是区别表达的并因此可充当肿瘤标记物。这样的蛋白质在癌相关的过程中起作用，癌相关的过程包括，但不限于，血管发生、程序性细胞死亡、细胞分化、细胞信号传导、血细胞生成、激素控制和免疫反应。示例性肿瘤标记物包括，但不限于，恶性胸腔积液和腹膜癌扩散两者的癌胚抗原CEA；IV期乳腺癌的人表皮生长因子受体2HER-2neu；尿路上皮细胞癌的膀胱肿瘤抗原；甲状腺癌转移的甲状腺球蛋白；肝细胞癌的α胎蛋白；前列腺癌的前列腺特异性抗原PSA；非小细胞肺癌的癌抗原125CA125；胰腺癌的癌抗原19.9CA19.9；乳腺癌的癌抗原15.3CA15.3；卵巢癌的瘦蛋白、催乳素、骨调素和胰岛素样生长因子IIIGF-II的组合；肺癌的CD98、肌成束蛋白、聚合免疫球蛋白受体sPIgR的分泌链和14-3-3η蛋白的组合；心肌梗塞的肌钙蛋白I和充血性心力衰竭的B型促钠排泄肽。其它常见肿瘤标记物包括乳腺癌的雌性激素受体孕酮受体ERPR、HER-2neu和表皮生长因子受体EGFR以及与血清HER2阳性乳腺癌相关的金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-1；结肠直肠癌的柯斯顿Ras致癌基因KRAS和UDP葡糖醛酸基转移酶家族1成员AUGT1A1；胃癌的HER-2neu、c-KIT、CD20抗原、CD30和与PAPOLA和CPSF1血小板衍生的生长因子受体α融合蛋白FIP1L1-PDGRFα相互作用的因素factoril以及胃肠道间质瘤GIST的血小板衍生的生长因子受体PDGFR；白血病淋巴瘤的费城染色体BCRABLPMLRARα和间变性淋巴瘤激酶TPMTUGT1A1ALKEGFR；肺癌的KRASEGFR和黑素瘤的BRAF与S100。肿瘤标记物的其它实例包括在癌症中失去的肿瘤抑制物，如乳腺癌基因1BRCA1、乳腺癌基因2BRCA2；RNA，如mRNA、微小RNA；体液或组织中发现的蛋白质如前列腺特异性抗原和CA-125；基于基因和蛋白质的生物标记物；和非特异性生物标记物如体液中的氨基葡聚糖；骨骼参与skeletalinvolvement中的碱性磷酸酶和尿羟脯氨酸；骨病中的透明质酸分泌和尿羟脯氨酸，和其组合。与重要的兽医学恶性肿瘤如犬恶性黑素瘤CMM——狗和牛眼鳞状细胞癌中最常见的口肿瘤——相关的肿瘤标记物也可利用本发明的融合蛋白和VLP来呈现。在另一优选实施方式中，免疫原性多肽是能够适于或被设计以诱导针对变应原的免疫应答的多肽。变应原的非限制示例性实例包括，但不限于，来自树木和花例如多年生黑麦草Loliumperenne、草地早熟禾Poapratense、梯牧草Phleumpratense、狗牙根Cynodondactylon、草甸羊茅Festucapratensis、鸭茅Dactylisglomerata、黑麦Secalecereale、大麦Hordeumvulgare、燕麦Avenasativa、普通小麦Triticumsativa、北艾Artemisiavulgaris、藜Chenopodiumalbum、长叶车前Plantagolanceolata、菊蒿Taraxacumvulgare、欧蓍草Parietariajudaica、刺沙蓬Salsolakali、大荨麻Urticadioica、齐墩果Oleaeuropea、悬铃木属Platanusspp.、柏木属Cupressusspp的花粉的蛋白质提取物、昆虫例如屋尘螨、粉尘螨、壁虱属例如粗脚粉螨、热带无爪螨Blomiatropicalis、宇尘螨、家甜食螨、害嗜鳞螨Lepidoglyphusdestructor、腐食酪螨Tyrophagusputrescentiae的蛋白质提取物、真菌的或动物皮屑的例如青霉菌属、链格孢Alternariaalternata、草本枝孢菌Cladosporiumherbarum、狗皮屑、猫皮屑、马皮屑的蛋白质提取物和食物或食物产品的蛋白质提取物。在优选实施方式中，免疫原性多肽来自病毒的蛋白质。优选地，病毒是HIV。在优选实施方式中，免疫原性多肽不包含来自HIVgag多肽的表位。在另一优选实施方式中，免疫原性多肽来自HIV病毒的Env蛋白或来自Env蛋白的加工导致的产物。在优选实施方式中，HIV的Env蛋白的序列包含SEQIDNO：21，或其功能等同变体。在优选实施方式中，Env蛋白的加工导致的产物是gp41，或功能等同变体。gp41多肽的功能等同变体优选地具有其参考多肽的形成活性的至少60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％。技术人员知晓若干检测HIVgag多肽功能变体的VLP形成的技术。在优选实施方式中，gp41变体序列包含SEQIDNO：5和包含gp41HR2区和MPER区。在另一优选实施方式中，免疫原性多肽的大小少于90个氨基酸、少于80个氨基酸、少于70非氨基酸或少于60个氨基酸。在另一优选实施方式中，免疫原性多肽从N端到C端包含：aHIVgp41多肽或其功能等同变体的HR2区，和bHIVgp41多肽或其功能等同变体的MPER区。gp41HRl和HR2序列是本领域公知的。在优选实施方式中，HR2区包含SEQIDNO：22。优选地，在HXB2Env蛋白的具体情况中，MPER区包含SEQIDNO：23。由于在形成根据本发明的gp41变体的区域的结构中可进行修饰和变化并且仍获得具有相同的或另外期望的特征的分子，因此这种功能等同物也包括在本发明的范围内。出于本发明的目的，免疫原性组合物即具有充分的“免疫原性活性”中用作抗原的多肽可通过本领域通常已知用于当向宿主有机体给予时测量给定多肽引起对所述多肽特异的抗体的产生的能力的任何方法来鉴定。根据本发明的多肽的给定变体成为免疫学等同变体的能力可使用标准中和试验来确定，其中疑似suspected变体被接种到测试动物中并且产生的抗体被测试其中和HIV毒株对易感细胞的感染的能力。根据本发明的免疫原性多肽的免疫学功能等同物可通过修饰多肽获得。所述修饰可以是，不限制地，氨基酸变化、缺失、截断、多肽片段、与其它多肽融合、插入或其任意组合。因此，免疫原性多肽的免疫学功能等同物显示关于天然免疫原性多肽中对应区域的所示氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的同一性程度，条件是维持参考多肽的免疫原性活性。优选地，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域，或更优选地长度为至少50-100个氨基酸或核苷酸的区域。如下所述，两个核酸序列或多肽基本上是相同的指示在于第一核酸编码的多肽免疫学上与针对第二核酸编码的多肽引起的抗体交叉反应。因此，多肽一般基本上与第二多肽相同，例如，在两个肽仅因保守替换而不同的情况下。两个肽之间的同一性程度可使用本领域技术人员公知的计算机算法和方法确定。两个肽的两个氨基酸序列之间的同一性优选地使用BLASTP算法确定。参见Altschul,S.等，“BLASTManual”,NCBINLMNIHBethesda,Md.20894,Altschul,S.等，J.,1990,Mol.Biol.215:403-410。作为被考虑在本发明的范围内的修饰的实例，多肽结构中某些氨基酸可代替其它氨基酸而不明显appreciable损失该结构的相互作用结合能力如，例如，被抗体识别和结合的抗原表位。由于正是多肽的相互作用能力和性质限定了其生物学例如免疫学功能活性，因此在氨基酸序列或其基本的DNA编码序列中可进行某些氨基酸序列替换，并且却得到具有相当性质的多肽。可对本发明抗原的氨基酸序列进行各种改变而不明显损失免疫原性活性。本领域应当理解，为了作出功能等同氨基酸替换，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予多肽相互作用式生物学功能中的重要性通常被本领域所理解。参见KyteJ等，J.Mol.Biol.1982；151:105-132。已知某些氨基酸可代替具有相似亲水指数或分数的其它氨基酸并仍保持相似的生物学活性。在基于亲水指数作出改变上，优选其亲水指数在正或负2以内的氨基酸的替换，尤其优选在正或负1以内的那些，和甚至更特别优选在正或负0.5以内的那些。每一个氨基酸基于其疏水性和电荷特征都被指定分配，assigned了亲水指数；这些是：异亮氨酸+4.5、缬氨酸+4.2、亮氨酸+3.8、苯丙氨酸+2.8、半胱氨酸胱氨酸+2.5、甲硫氨酸+1.9、丙氨酸+1.8、甘氨酸-0.4、苏氨酸-0.7、丝氨酸-0.8、色氨酸-0.9、酪氨酸-1.3、脯氨酸-1.6、组氨酸-3.2、谷氨酸盐-3.5、谷氨酰胺-3.5、天冬氨酸盐-3.5、天冬酰胺-3.5、赖氨酸-3.9和精氨酸-4.5。本领域还理解的是，可基于其亲水性有效作出相似氨基酸的替换；具体地在由此被创建的免疫学功能等同多肽意图用于作为本发明的某些实施方式的免疫学实施方式的情况下。由其相邻氨基酸的亲水性掌控的蛋白质的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关联。参见HoppT,US4554101。在基于相似亲水性数值作出改变中，优选其亲水性数值在正或负2以内的氨基酸的替换，特别优选在正或负1以内的那些，和甚至更特别优选在正或负0.5以内的那些。以下亲水性数值被指定给氨基酸残基：精氨酸+3.0、赖氨酸+3.0、天冬氨酸盐+3.0正或负1、谷氨酸盐+3.0正或负1、丝氨酸+0.3、天冬酰胺+0.2、谷氨酰胺+0.2、甘氨酸0、苏氨酸-0.4、脯氨酸-0.5正或负1、丙氨酸-0.5、组氨酸-0.5、半胱氨酸-1.0、甲硫氨酸-1.3、缬氨酸-1.5、亮氨酸-1.8、异亮氨酸-1.8、酪氨酸-2.3、苯丙氨酸-2.5和色氨酸-3.4。本领域公知，在某些残基显示为对蛋白质或肽的免疫学性质或结构性质尤其重要的情况下，比如例如，结合区或表位中的残基，这种残基通常可不被交换。以此方式，功能等同物在本文被限定为维持其大量的天然免疫学活性的那些多肽。总体上，分子长度越短，在不影响其功能的情况下，对分子作出的变化越少。较长的结构域可具有中间数量的变化。全长蛋白质将对大量变化具有最大的容限耐受，tolerance。然而，必须承认的是高度取决于其结构的某些分子或结构域可能耐受少量修饰或可能不耐受修饰。如下所述，也可通过由与编码天然免疫原性多肽的区域的分子基本上相同的核酸序列或其互补部分在严格条件下相互杂交的核酸序列表达来获得免疫学等同变体，条件是保留所述核酸编码的多肽的免疫原性活性。严格条件是序列依赖性的并且在不同环境下将会不同。较长序列尤其在较高温度下杂交。参见TijssenS,“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays”,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiologyElsevierSciencePublishersB.V.,Amsterdam,NL1993。通常，严格条件选为在限定的离子强度pH下低于具体序列的热熔点Tm约5-10℃。TM是这样的温度在限定的离子强度、pH和核酸浓度下：在该温度下50％的与靶标互补的探针与靶序列在平衡状态下杂交由于靶序列过量存在，在TM下，50％的探针在平衡状态下被占据饱和occupied。严格条件将是这样的：其中盐浓度少于约1.0M的钠离子，一般在pH7.0至8.3下钠离子或其它盐浓度约0.01至1.0M，并且对于短探针例如10至50个核苷酸温度是至少约30℃和对于长探针例如多于50个核苷酸温度是至少约60℃。还可通过加入去稳定剂如甲酰胺来达到严格条件。对于高严格性杂交来说，阳性信号是至少两倍的背景，优选10倍的背景杂交。实例性高严格性或严格杂交条件包括：50％的甲酰胺、5×SSC和1％的SDS在42℃下温育或5×SSC和1％的SDS在65℃下温育，其中在65℃下用0.2×SSC和0.1％的SDS洗涤。本领域技术人员将理解，形成根据本发明的融合蛋白的部分的不同组分可通过接头区被功能地直接或间接连接。在优选实施方式中，根据本发明的融合蛋白进一步包含至少一个接头。优选地，接头包含甘氨酸残基，和更优选地甘氨酸和丝氨酸残基。甚至更优选地，接头包含三个甘氨酸残基和一个丝氨酸残基。优选地，接头包含序列SEQIDNO：24或SEQIDNO：25。更优选地，接头序列选自序列SEQIDNO：24和SEQIDNO：25。在另一优选实施方式中，根据本发明的融合蛋白进一步包含标签，所述标签可用于使用显示与所述标签特异性亲和的试剂检测或纯化gp41变体。充分的检测纯化标签包括六-his金属螯合物部分、六-hatGST谷胱甘肽S转移酶谷胱甘肽亲和、钙调蛋白结合肽CBP、strep标签、纤维素结合结构域、麦芽糖结合蛋白、S肽标签、几丁质结合标签、免疫反应表位、表位标签、E2标签、HA表位标签、Myc表位、FLAG表位、AU1和AU5表位、GIu-GIu表位、KT3表位、IRS表位、Btag表位、蛋白激酶C表位、VSV表位或任何其它标签，只要标签不影响蛋白质的稳定性或所附接的抗原的免疫原性。可将若干种类氨基酸序列添加至根据本发明的融合蛋白以达到不同目标，如，例如，促进其处理或监测其表达。将这些肽序列添加到根据本发明的融合蛋白不影响它们的功能上或免疫原性的能力。在优选实施方式中，接头序列包含序列SEQIDNO：26、SEQIDNO：27或SEQIDNO：28。优选地，接头序列选自序列SEQIDNO：26、SEQIDNO：27和SEQIDNO：28。在另一优选实施方式中，根据本发明的融合蛋白包含序列SEQIDNO：29。3.核酸、载体和宿主细胞a核酸在另外的方面，本发明涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。在优选实施方式中，根据本发明的多核苷酸包含序列SEQIDNO：9。在优选实施方式中，根据本发明的多核苷酸的序列根据为了其表达而选择的宿主被密码子优化。在另一优选实施方式中，编码根据本发明的免疫原性多肽的密码子优化的序列包含序列EQIDNO：11。在另外的优选实施方式中，编码根据本发明的HIVgag多肽的密码子优化的序列包含序列EQIDNO：13。技术人员已知用于密码子优化的多种方法和软件工具。用于根据本发明的用途的密码子优化的核酸可通过用高频率出现在所选宿主基因组中的密码子例如“人源化”密码子，在高表达的人基因中频繁出现的密码子替换编码免疫原的核酸的密码子来制备。在优选实施方式中，根据本发明的密码子优化的多核苷酸即人包含序列SEQIDNO：15。本发明的多核苷酸可以可操作地连接至能够在导入宿主细胞后驱动核酸表达的任何启动子或增强子。启动子是一组anarrayof指导核酸转录的核酸控制序列。如就聚合酶II型启动子TATA元件而言，启动子包括其可以在转录起始位点附近的必要核酸序列。启动子还可包括远侧增强子或阻遏元件，其位置可以距转录起始位点多达数千碱基对。包括组成型constitutive启动子和可诱导型inducible启动子。出于克隆、执行其它实验室操作、制备重组肽或基因递送的目的，可将根据本发明的多核苷酸并入载体中。b载体在进一步方面中，本发明涉及包含根据本发明的多核苷酸的载体。本领域技术人员将理解不存在对可与本发明一起使用的载体类型的限制。载体可以是适用于增殖和用于获得多核苷酸的克隆载体、并入到若干异源有机体的基因构建物或表达载体。因此，根据本发明的适合的载体包括原核表达载体例如pUC18、pUC19、Bluescript及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、CoIEl、pCRl、RP4、噬菌体和穿梭载体例如pSA3和pAT28、酵母表达载体例如2微米质粒类型的载体、整合质粒、YEP载体、着丝粒质粒和类似物、昆虫细胞表达载体例如pAC系列和pVL系列载体、植物表达载体如在植物中表达的载体例如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE系列载体、和基于病毒载体例如腺病毒、与腺病毒相关的病毒以及逆转录病毒和慢病毒的真核表达载体、以及非病毒载体如pSilencer4.1-CMVAmbion,AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA、pcDNA3、pcDNA3.1hyg、pHCMVZeo、pCR3.1、pEFlHis、pINDGS、pRcHCMV2、pSV40Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6V5-His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVL和pKSV-10、pBPV-1、pML2d和pTDTl。在优选实施方式中，载体是pcDNA3.1。在具体实施方式中，载体是可包含调控元件的表达载体，所述调控元件如巨细胞病毒hCMV即时早期基因、SV40腺病毒的早期启动子、SV40腺病毒的晚期启动子、lac系统、TAC系统、TRC系统、噬菌体的主要操纵子和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子或酵母交配因子的启动子。实例性载体包括，但不限于，细菌人工染色体、粘粒、酵母人工染色体、噬菌体、质粒、脂质载体和病毒载体例如逆转录病毒。先前已描述了适用于融合蛋白的表达载体。参见Kayman,US5643756。c宿主细胞在另一方面中，本发明涉及包含根据本发明的融合蛋白、编码所述融合蛋白的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体的宿主细胞。适用于本发明的细胞不限制地包括哺乳动物、植物、昆虫、真菌和细菌性细胞。细菌性细胞包括，但不限于，革兰氏阳性细菌性细胞如芽孢杆菌种属、链霉菌属和葡萄球菌属的种以及革兰氏阴性细菌性细胞如埃希氏菌属和假单胞菌属的细胞。真菌细胞优选地包括酵母细胞如酵母属、毕赤酵母和多形汉森酵母。昆虫细胞包括，但不限于，果蝇细胞和Sf9细胞。植物细胞除了其它以外包括农作物植物如谷物类、药用类、观赏类或球根类植物的细胞。哺乳动物细胞包括，但不限于，中国仓鼠卵巢CHO细胞如CHO-KlATCC登记号CCL-61、DG44ChasinL等，Som.CellMol.Genet.1986；12:555-556；和KolkekarA等，Biochemistry1997；36:10901-10909、CHO-KlTet-OnClontech,MountainView,CA,USA、CHO指定的designatedECACC85050302CAMR,Salisbury,Wiltshire,UK、CHO克隆13GEIMG,Genova,IT、CHO克隆BGEIMG,Genova,IT、CH0-K1SF指定的ECACC93061607CAMR,Salisbury,Wiltshire,UK、RR-CHOKl指定的ECACC92052129CAMR,Salisbury,Wiltshire,UK、对二氢叶酸还原酶阴性的CHO细胞CHO-DHFR,UrlaubG等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1980；77:4216-4220、SV40转化的猴肾CVl细胞COS、COS-7，ATCC登记号CRL-1651；人胚胎肾细胞HEK-293、HEK-293T细胞；幼仓鼠肾细胞BHK，ATCC登记号CCL-IO；猴肾细胞CVl，ATCC登记号CCL-70；非洲绿猴肾细胞VERO-76，ATCC登记号CRL-1587；VERO，ATCC登记号CCL-81；小鼠塞尔托利细胞mouseSertolicellsTM4，MatherJ,Biol.Reprod.1980；23:243-251；人宫颈癌细胞HELA，ATCC登记号CCL-2；狗肾细胞MDCK，ATCC登记号CCL-34；人肺细胞W138，ATCC登记号CCL-75；人肝癌细胞HEP-G2、HB8065；小鼠乳腺肿瘤细胞MMT060562，ATCC登记号CCL-51；布法罗大鼠buffalorat肝细胞BRL3A，ATCC登记号CRL-1442；TRI细胞MatherJ,Ann.NYAcad.Sci.1982,383:44-68；MCR5细胞和FS4细胞。优选地，使用的宿主细胞是HEK-293T细胞。在优选实施方式中，根据本发明的宿主细胞是重组细菌。在优选实施方式中，细菌是革兰氏阴性细菌性细胞，并且该术语意图包括肠杆菌科如埃希氏菌属、志贺氏菌属、柠檬酸杆菌属、沙门氏菌属、克雷伯杆菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克罗非菌属、沙雷氏菌属、西地西菌属Cedeceaspp.、摩根氏菌属、哈夫尼菌属Hafhiaspp.、爱德华氏菌属、普罗维登斯菌属、变形菌属和耶尔森菌属的所有兼性革兰氏阴性细胞。先前关于本发明的融合蛋白所述的所有术语和实施方式都同等适用于根据本发明的多核苷酸、载体或宿主细胞。4.制备VLP的方法在再进一步方面中，本发明涉及用于制备装载有目标多肽的VLP的方法，其包括：a在细胞中表达根据本发明的融合蛋白，和b从胞外培养基回收VLP。根据本发明的方法的第一步骤包括用包含根据本发明的多核苷酸的载体转化宿主细胞。所述转化可通过本领域普通技术人员公知的常规技术执行。在宿主是原核如大肠杆菌的情况下，可从对数生长期后收获的细胞制备能够摄入DNA的感受态细胞并随后利用本领域公知的程序通过CaCl2方法进行处理。可选地，可使用MgCl2或RbCl。如果需要，转化也可在形成宿主细胞的原生质体后或通过电穿孔来进行。当宿主是真核细胞时，这种DNA转染的方法如磷酸钙共沉淀、常规机械程序如包装在脂质体或病毒载体中的质粒的微注射、电穿孔、插入可以被使用。还可用编码免疫原性gp120多肽的多核苷酸序列和编码可选择表型的第二外源DNA分子如单纯性疱疹胸苷激酶基因共转化真核细胞。另一种方法是使用真核病毒载体，如猿猴病毒40SV40或牛乳头状瘤病毒，从而瞬时感染或转化真核细胞并表达蛋白质。细胞培养应当维持在适当的条件下以允许表达根据本发明的多核苷酸。根据本发明的方法的第二步骤包括例如通过离心和经0.45μm过滤器过滤从胞外培养基回收VLP。在使用根据本发明的融合蛋白获得的VLP的情况下，VLP的特征在于具有脂质包膜包封的病毒衣壳，其中脂质包膜源自形成VLP的细胞。在另一方面中，本发明涉及包含根据本发明的或利用根据本发明的方法获得的融合蛋白的病毒样颗粒。先前所述的所有术语和实施方式同等适用于制备根据本发明的VLP的方法和根据本发明的VLP。5.药物组合物在进一步方面中，本发明涉及包含根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或病毒样颗粒、或其组合的药物组合物。根据本发明的药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体在所使用的剂量和浓度下本质上对接受者是非毒性的，并且可与制剂的其它成分相容。例如，用于包含多肽的制剂的载体通常不会包括已知对多肽有毒害的氧化剂和其它化合物。适合的载体包括，但不限于水、右旋糖、甘油、盐水、乙醇及其组合。载体可包含增强制剂的效用的另外的剂如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂或佐剂。根据本发明的药物组合物可通过本领域技术人员已知的任何手段来给予，如通过肌肉内、皮下或静脉内注射，和口、鼻或肛门给予。参见BangaA,治疗多肽和蛋白质中的“ParenteralControlledDeliveryofTherapeuticPeptidesandProteins,”TechnomicPublishingCo.,Inc.,Lancaster,PA,USA,1995。根据本发明的目标多肽可作为移植物、油性注射或作为颗粒系统来提供，从而延长其治疗益处例如增加免疫原性应答。颗粒系统可以是微粒、微胶囊、微球体、纳米胶囊或类似的粒子。参见上文Banga,1995。优选地，根据本发明的药物组合物是肠胃外给予的。根据本发明的药物组合物可配制成适于精确剂量单独给予的单位剂型。治疗有效量的药物组合物可以以单一剂量或多剂量给予，例如每日、治疗过程中或作为预防方案protocol的部分。具体地，非限制性实例，根据本发明的药物组合物的脉冲剂量包括至少每日、至少每周和至少每月给予的方案regimens。药物组合物给予的剂量、频率和途径可由技术人员根据受试者的需要并按照人类医学和兽医学中可适用的方案改变。根据本发明的药物组合物的治疗有效量可取决于疾病的严重性和受试者的年龄、体重、一般状态以及其它临床因素，如受试者对目标多肽的敏感性。因此，适当的治疗方案的最终确定将由主治医师作出。一般地，体外使用的剂量可提供对用于原位给予药物组合物的量的有用指导，并且动物模型可用于确定治疗具体病症的有效剂量。参见GilmanR等，Eds.,Goodman和Gilman：ThePharmacologicalBasisofTherapeutics，第八版PergamonPress,NewYork,NY,US,1990，和GennaroA,Ed.,Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版MackPublishingCo.,Easton,PA,US,1990。一般地，剂量范围为约0.1μgkg体重到约100mgkg体重。其它适合的范围包括约1μgkg到10mgkg体重的剂量。在一个实例中，剂量为约1.0μg到约50mg，例如，1μg到1mg，如每名受试者1mg肽。a免疫原性组合物或疫苗组合物在优选实施方式中，根据本发明的药物组合物是免疫原性组合物或疫苗组合物。所述免疫原性组合物或疫苗组合物包含治疗有效量的根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或病毒样颗粒、或其组合。根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物可进一步包含药学上可接受的载体和其它赋形剂如佐剂。可与根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物一起使用的佐剂的实例包括，但不限于，AlKSO42、AlNaSO42、AlNH4SO4、二氧化硅、明矾、AlOH3、Ca3PO42、高岭土、碳、氢氧化铝、胞壁酰二肽、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺thr-DMP、N-乙酰基-nornuramyl-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺CGP11687，也被称为nor-MDP、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-1'2'-二棕榈酰基-sn-丙三醇-3-羟磷酰氧基-乙胺CGP19835A，也被称为MTP-PE、2％鲨烯吐温乳剂中的RIBIMPL+TDM+CWS、脂多糖及其各种衍生物，包括脂质A、弗氏完全佐剂FCA、弗氏不完全佐剂、Merck佐剂65、多核苷酸例如，polyIC和polyAU酸、来自结核分枝杆菌的蜡D、短小棒状杆菌，百日咳杆菌和布鲁氏杆菌属成员中发现的物质、Titermax、ISCOMS、QuilA、ALUN、脂质A衍生物、霍乱毒素衍生物、HSP衍生物、LPS衍生物、合成的肽基质matrixes或GMDP、白细胞介素1、白细胞介素2、MontanideISA-51和QS-21、CpG寡核苷酸、polyI:C和GM-CSF。参见Hunter,US5554372和Jager,WO1997028816。基于合成聚合物的颗粒载体据已经显示除提供控释以外还充当佐剂以增强免疫应答。铝盐也可用作产生免疫应答的佐剂。在优选实施方式中，根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物包含治疗有效量的根据本发明的病毒样颗粒并且不含佐剂。在更优选的实施方式中，根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物基本不含有磷酸铝。无论何时期望其治疗效果例如减少HIV-1感染的体征signs、症状或实验室结果都可以给予根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物。通常，剂量足以治疗或缓解疾病的症状或体征而不对受试者产生不能接受的毒性。可使用全身或局部给予。可根据接触抗原促进primeboost方案给予受试者免疫原性组合物或疫苗组合物，由此在组合物的第一给予之后在不同时期使用相同或不同剂量至少一次第二给予以加强或维持针对目标多肽即免疫原的受试者免疫应答。先前所述的所有术语和实施方式同等适用于根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物。6.治疗方法在另一方面中，本发明涉及用于医学的根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合。在优选实施方式中，根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合用于人类医学。在另一优选实施方式中，根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合用于兽医学。在再进一步方面中，本发明涉及用于治疗或预防受试者中由感染或肿瘤引起的疾病的根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合。在优选实施方式中，受试者是人类。在另一优选实施方式中，受试者是农场动物或伴侣动物。在该方面的可选形式中，本发明涉及治疗或预防受试者中由感染或肿瘤引起的疾病的方法，包括给予受试者治疗有效量的根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合。在该方面的进一步可选形式中，本发明涉及根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合在制备用于治疗或预防受试者中由感染或肿瘤引起的疾病的药物的用途。在另外方面中，本发明涉及用于将治疗剂递送到细胞或用于诊断的根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合。在优选实施方式中，目标多肽是HIV多肽。在更优选的实施方式中，HIV多肽包含gp41或其功能等同变体的MPER区。优选地，受试者是人、黑猩猩、猕猴或狒狒。更优选地，受试者是人。可使用根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合治疗或预防的其它疾病包括由病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生虫引起的传染性疾病。可使用根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合治疗或预防的病毒或病毒性感染的实例包括，但不限于,腺病毒、巨细胞症病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、汉坦病毒hantavirus、登革热、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、单纯性疱疹I型、单纯性疱疹II型、人类免疫缺陷病毒HIV、人乳头状瘤病毒HPV、流感、麻疹、腮腺炎、乳多泡病毒、脊髓灰质炎、呼吸道合胞体病毒、牛痘、鼻病毒、轮状病毒、风疹、SARS病毒、天花和脑膜炎病毒。适合的细菌或细菌性感染的实例包括，但不限于，炭疽杆菌、博氏疏螺旋体、空肠弯曲杆菌、沙眼衣原体、肉毒梭状芽孢杆菌、破伤风杆菌、白喉属、大肠杆菌、军团杆菌属、幽门螺杆菌属、立克次氏体分支杆菌Mycobacteriumrickettsia、奈瑟菌支原体Mycoplasmanesisseria、百日咳属、绿脓杆菌、肺炎链球菌S.pneumonia、链球菌属、葡萄球菌属、霍乱弧菌和鼠疫耶氏菌。适合的真菌或真菌感染的实例包括，但不限于，烟曲霉、皮炎芽生菌、白色念珠菌、粗球孢子菌、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌和马尼弗青霉菌。适合的原生动物和寄生虫或真菌或原生动物和寄生性感染的实例包括，但不限于，衣原体属、利什曼原虫属、疟原虫属例如疟疾、立克次氏体属和锥体虫属。根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合还可用于抵抗抵消、中和，counteracting涉及生物恐怖主义的病原体，如，例如，肉毒杆菌毒素、炭疽杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、出血性结膜炎病毒肠道病毒70和轮状病毒。根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物、或其组合可另外用于治疗或预防慢性状况，如阿尔茨海默病、帕金森氏病和类风湿性关节炎或其它状况，如变态反应和肿瘤。后者的实例可由同时包括针对肿瘤标记物的抗体或抗体片段或用于放射疗法的放射性元件的嵌合蛋白构成。根据本发明的融合蛋白和由所述融合蛋白诱发而衍生的抗体还可用于诊断生育力和怀孕或诊断疾病如结肠癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌。这些融合蛋白还可用于监测和控制药物滥用或治疗性治疗的进展。本发明进一步涉及预防或减少与HIV感染有关的症状。这些包括与HIV感染的轻微minor症状期相关的症状，包括，例如，带状疱疹shingles、皮疹和指甲感染、口疮、复发性鼻和咽喉感染和体重减轻。此外，与HIV感染的主要major症状期相关的进一步症状包括，例如，口部和阴道鹅口疮口腔和阴道念珠性感染，oralandvaginalthrush念珠菌、持续性腹泻、体重减轻、持续性咳嗽、再活化的结核病reactivatedtuberculosis和复发性疱疹感染，如感冒疮单纯性疱疹。可根据本发明治疗的充分发展的AIDS的症状包括，例如，腹泻、恶心和呕吐、鹅口疮和口疮、持续性、复发性阴道感染和宫颈癌、持续性全身淋巴结病PGL、严重的皮肤感染、疣和癣、呼吸道感染、肺炎，尤其是卡氏肺囊虫性肺炎PneumocystiscariniipneumoniaPCP、带状疱疹herpeszoster或带状疱疹shingles、神经系统问题，如疼痛、手和脚的麻木或“发麻”针刺感，pinsandneedles、神经学异常、卡波西肉瘤、淋巴瘤、结核病和其它机会性感染。根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒和药物组合物、或其组合可在受试者中诱导抗体的表达。在一个实施方式中，抗体是中和抗体即nAbs。在优选实施方式中，根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒和药物组合物、或其组合用于在HIV暴露下在未感染的受试者中预防HIV感染或AIDS。根据本发明的融合蛋白还可在养殖伴侣动物和农场动物及鱼中具有多种用途。这些融合蛋白可用于制备这样的免疫原性组合物或疫苗组合物：抵抗动物逆转录病毒如猫白血病病毒FeLV，而且也抵抗非病毒性病原体如布鲁氏杆菌属——一种在牛中引起多种问题的细菌剂，或抵抗鲑鱼立克次氏体Piscirickettsiasalmonis——其主要影响鲑鱼的商业养殖。根据本发明的融合蛋白的其它可能的用途是制备抵抗猪肺炎支原体——一种在猪中产生巨大损失的肺炎剂——的疫苗。还可能使用根据本发明的融合蛋白来调节某些激素的表达，从而加快养殖动物farminganimals的生长速率和增加奶的产生，或使其肉更精瘦。这些非常规适应症的一个实例将是使用这些实体来免疫阉割免疫去势，immunocastration农场动物，如猪。一般地，本发明的方法中使用的中和抗体结合到病原体的表面，并且在缺少所述抗体一种或多种的情况下或在存在阴性对照的情况下相对于病原体导致的感染抑制或减少病原体导致的感染至少99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或10％。然后可利用本文提供的任何方法测试nAbs来确定其是否广泛中和即bnAbs。如果nAbs或bnAbs在非人动物中引起，则CDR或完全序列可从非人框架转移至人框架，以产生适用于给予人的抗体。本领域已描述用于确定抗体是否是nAb的方法。参见LiM等，J.Virol.2005；79:10108-10125,WeiX等，Nature2003；422:307-312,和MontefioriD,Curr.Protoc.Immunol.2005；Jan,Chapter12:Unit12.11。这些方法基于在使用利用编码报告基因的病毒的感受性细胞系进行一轮asingleroundof病毒性感染之后报告基因表达降低的确定。在另一优选实施方式中，融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或病毒样颗粒用于根据本发明的用途，其中用缀合物事先处理受试者，所述缀合物包含形成偶联至载体的融合蛋白的部分的免疫原性多肽。在优选实施方式中，免疫原性多肽对应于HIVgp41多肽或其功能等同变体的任何区域。优选地，该区域是MPER区。更优选地，MPER区包含SEQIDNO：23。在另一优选实施方式中，载体是KLH钥孔戚血蓝素。7.试剂盒kit在进一步方面中，本发明涉及包含根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒或药物组合物中的至少一种或其组合的试剂盒。根据本发明的试剂盒的组分可任选地包装在适当的容器中并被贴标签用于其预期用途，包括治疗或预防传染性疾病。在一个实施方式中，传染性疾病是HIV、AIDS或其相关疾病或状况。试剂盒的组分可以以水溶液，优选地无菌水溶液，或以用于重构的冻干制剂，优选地无菌冻干制剂储存在单位剂量或多剂量容器中。容器可由各种材料如玻璃或塑料形成，并且可具有无菌入口例如容器可以是静脉内溶液袋或是具有可通过皮下注射针刺穿的止动件的小瓶。试剂盒可进一步包括包含药学上可接受的载体的更多个容器。它们可进一步包括商业和用户的立场所期望的其它材料，包括，但不限于，缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器、用于一种或多种适合的宿主细胞的培养基或其它活性剂。试剂盒可包含习惯上包括在治疗产品的商业包装中的说明书，所述说明书包含关于以下的信息，例如，适应症、使用、剂量、生产商、给药、有关这种治疗产品用途的禁忌症或警示。本文中所有提到的出版物通过引用以其全部内容并入。现已总体上描述了本发明，通过参考以下实例将会更容易地理解本发明，以下实例通过示例的方式给出并且不意图限制本发明，除非另有说明。常规程序1.用于小gp41衍生的蛋白质、gag和融合蛋白的表达载体先前已描述了编码包含C端HR2区、MPER和TM结构域的小蛋白质的pMIN哺乳动物表达质粒。参见Molinos-AlbertL等，Retrovirology2014,11:44。还产生了编码包含gp41的MIN序列和胞质尾区的gp41衍生的蛋白质的类似质粒pMINFULL。参见图1。MIN序列被克隆在pET-21D+表达载体Novagen,MerckKGaA,Darmstadt,DE中，用于大肠杆菌产生重组蛋白。使用了序列SEQIDNO:14tgatga的终止密码子。从pGag-EGFP质粒扩增Gag序列，该质粒编码以框架融合至增强的GFP的Rev非依赖性HIV-1Gag蛋白。质粒获自NIHAIDSReagentProgramCatNo.11468。参见DhillonA等，J.Virol.2007；81:6548-6562。以框架亚克隆gag扩增子至pcDNA3.1MIN质粒，从而产生编码融合蛋白MINGAG的pcDNA3.1MINGAG-3.7质粒。通过从pGag-EGFP质粒切除gag编码序列并亚克隆至pcDNA3.1质粒Invitrogen，Carlsbad,CA,USA；Cat.Nos.K4900-01,K4900-40来产生编码完全Gag序列的pGAG质粒。参见图1。所有扩增反应都利用PlatinumTMTaq高保真DNA聚合酶ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA在2720热循环仪AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA中进行。测序所有质粒以确认预期的序列和插入位点。2.肽、gp41衍生的蛋白质和VLP使用C34、T-20和MPER肽HXB2序列和钥孔戚血蓝素KLH和偶联至KLH的MPERKLH-MPERThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA。C.BranderIrsiCaixa,Badalona,ES友好地提供了涵盖gp41HR2和MPER区的15-mer重叠肽。在大肠杆菌BL21DE3菌株Invitrogen,ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA中产生包含C端6×His标签的MIN蛋白。参见图1A。包含体获自1L培养细菌提取物并通过使用8M尿素溶液溶解。通过基于镍niquel的固化金属亲和色谱GEHealthcare,Inc.,Stamford,CT,USA和使用SephacrylS-200HR柱的凝胶过滤GEHealthcare，Inc.，Stamford，CT，USA获得高纯度蛋白质。根据生产规模通过转染HEK-293T细胞的不同衍生物来获得VLP。为了稳定转染，我们利用calphos哺乳动物转染试剂盒TakaraBioInc.,Otsu，JP使用pMINFULL和pGAG、pGAG或pcDNA3.1MINGAG-3.7来转染HEK-293T细胞，并分别用遗传霉素加潮霉素、潮霉素或遗传霉素筛选转染细胞。考虑到MINGAGVLP较差的得率，以不同的配置设置，setting实施GAG和MINGAGVLP的大规模生产。大量pcDNA3.1MINGAG-3.7表达质粒利用大量制备maxiprep试剂盒QiagenNV,Venlo,NL来生产，并被用于HEK-293T细胞的瞬时转染。在1L培养烧瓶中产生GagVLP，而在5L袋中产生MINGAGVLP。转染后48小时，上清液被收集、超滤、浓缩至1L，就MINGAG而言和超离心。两种制剂都包含大量gag蛋白，所述gag蛋白通过纳米颗粒示踪分析NanoparticleTrackingAnalysisNTA,NanoSightLtd.,Malvern,GB和电子显微镜学来评价。3.抗原性研究为了评价VLP表面上的抗原暴露，用包含目标胞外表位和完全HIVgag序列的融合蛋白转染HEK-293T细胞。转染后24小时，细胞被收获并用针对细胞表面抗原的特异性抗体抗gp41抗体2F5、4E10或10E8或针对其它目标蛋白的特异性抗体染色，洗涤过量抗体后，利用FIX和细胞固定和细胞透化试剂盒ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA固定并透化细胞和用抗gag抗体Kc57BeckmanCoulter,BreaCA,USA胞内染色。最终洗涤后，在LSRII流式细胞仪BDBiosciences,SanJose,CA,USA中分析细胞。GAG阳性细胞中细胞-表面抗原阳性细胞的频率被用作抗原暴露的测量。4.免疫原性研究年龄为6–8周的雌性C57BL6小鼠HarlanSpragueDawleyInc.,Indianapolis,IN,USA用于鼠科免疫方案。小鼠组群每组5只小鼠以3周间隔用50μg重组蛋白或VLP进行皮下免疫。在免疫之前和在第3周通过上颌动脉穿刺收集血液样本。每日观察小鼠以记录体重变化。对于兔免疫，3至4个月大的新西兰白兔用不同免疫原进行皮下接种。对照兔组n＝4用完全gagDNA和裸VLP接触过抗原primed，在第0周和第3周用裸VLP免疫两次。第二组兔n＝4用编码HTI免疫原的DNA——完全HIVgag和完全HIVenv基因——接触过抗原，然后在第0周和第3周用MINGAGVLP免疫。参见MotheB等，J.Transl.Med.2011；9:208。在第1、3、4周和处死时收集血清。所有动物和饲养husbandry实验都根据可应用的规定和规章进行。5.酶联免疫吸附测定ELISA肽C34、T20、MPER、重叠的15mergp41肽或重组GAG或MIN蛋白用于包被96孔的MaxisorpNunc-immuno板ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA。在封闭后，用100μL预先稀释的血浆样本在4℃下温育板过夜。然后洗涤板并在室温下将100μL辣根过氧化物酶HRP缀合的Fab2山羊抗小鼠IgGFc特异性的，JacksonImmunoResearchLabs,Inc.,WestGrove,PA,USA分配持续一小时。将板用100μl二盐酸邻苯二胺OPD底物Sigma-Aldrich,SaintLouis,MO,USA显色并用100μL的4NH2SO4终止。在492nm下测量特异信号的光密度和在620nm下测量背景光密度。6.病毒和中和试验在全长p7312AHIV-2分子克隆GenBank登陆号L36874的背景下产生HIV-2嵌合体。包含HIV-1gp41MPERp7312A-C1、2F5p7312A-C3或4E10表位p7312A-C4的野生型HIV-2p7312A和HIV-2嵌合体的表达载体由G.M.Shawn宾夕法尼亚大学友好地提供。参见上文Dhillon,2007。通过将质粒转染到HEK-293T细胞中产生伪病毒。转染后的24小时后，上清液被收获、以0.45微米过滤和在-80℃下冻结病毒储液。使用先前所述的Env表达质粒和pSG3载体产生HIV-1分离物NL4.3、BaL、AC10和SVPB16作为伪病毒。参见Sánchez-PalominoS等，Vaccine2011,29:5250-5259。血浆样本的无细胞病毒中和通过基于标准TZM-bl的试验来测试。参见上文Sánchez-PalominoS,2011,Vaccine2011，29:5250-5259。简言之，在96孔培养板中，在37℃下使用200TCID50将100μL预先稀释的血浆样本与50μL伪病毒储液预温育一小时。然后，每孔加入包含10,000个TZM-bl荧光素酶报告靶细胞100μL。板在37℃和5％CO2下培养48小时。2F5、4E10和IgGb12PolymunScientificGmbH,Klosterneuburg,AT和抗CD4克隆SK3BDBiosciencesCorp.,FranklinLakes,NJ,USA用作对照。在试验前将血浆样本灭活56℃，30分钟。用右旋糖酐Sigma-Aldrich,SaintLouis,MO,USA处理TZM-bl报告细胞以增强感染性。荧光素酶底物——BritelitePlusPerkinElmer,Inc.,Waltham,MA,USA用于读出HIV感染性。实施例1呈递HIVMPER表位的VLP的产生MIN蛋白由于其高表达和在转染细胞的细胞-表面上适当的MPER暴露而被选择。参见上文Molinos-Albert,2014。作为测试其潜在免疫原性的第一方法，产生展现所选择的MIN蛋白的重组MIN蛋白和VLP两者。参见图1。对于重组MIN蛋白，在大肠杆菌中进行产生并且蛋白质被纯化为均一，显示预期的17kDa分子量。参见图2A。在C57BL6小鼠中测定重组MIN蛋白的免疫原性。用MIN的重组制剂3剂量，每剂量20μg免疫的动物显示针对该蛋白质的IgG反应性。这些IgG的反应性在磷酸铝作为佐剂存在的情况下被提高。参见图2B。对于VLP，gp41的细胞质结构域被加至MIN序列MINFULL构建，以在VLP芽生期间提高与Gag的相互作用。根据蛋白质表达和VLP生成来选择稳定表达MINFULL和GAGHIV-1蛋白两者的HEK-293T细胞克隆。所选择的克隆4G2A显示与平行选择和缺少gp41表达的表达GAG的HEK-293T细胞克隆相当的细胞表面MPER暴露和胞内GAG含量。参见图2B。来自这些克隆的上清液包含大部分处于高分子量形式300kDa的gag蛋白，表明VLP的适当形成。该发现进一步通过WB分析在对照细胞中包含GAG蛋白与在MINFULL和GAG共同表达细胞中包含GAG和GP41蛋白两者的离心的VLP和细胞裂解物而确认。参见图2C。在免疫原性试验中，在或不在佐剂磷酸铝的存在下用MIN–VLP三剂量，每剂量10μg总蛋白免疫的C57BL6小鼠相比于对照动物显示了不显著的抗gp41IgG应答，虽然可以容易地检测到针对HEK-293T细胞表面蛋白和HIV-1GAG抗原的高反应性。参见图2E。更进一步地，当针对四种病毒即NL4-3、BaL、AC-10和SVBP16的迷你图进行测定时，在任何动物中都未检测到明显的抗HIV-1中和活性——或是用MIN重组蛋白免疫或是用VLP免疫。实施例2工程化VLP：自包装式gp41-gag融合蛋白考虑到并入VLP中的低量MIN蛋白和HIV病毒体中报告的少量Env刺突spikes，假设上述方法中MIN蛋白较差地并入VLP中可能是个限制因素。那么，应考虑增加VLP表面上MPER表位的密度是否可能增强其免疫原性潜力。参见图2C，ZhuP等，Nature2006,441:847-885。为了测试该假设，构建了编码包含融合至HIV的GAG蛋白的gp41的HR2、MPER和TM区的融合蛋白的表达质粒pcDNA3.1MINGAG-3.7。将pcDNA3.1MINGAG-3.7质粒、对照pcDNA3.1GAG和空质粒转染到HEK-293T细胞中并通过流式细胞术或蛋白质印迹分析gp41和Gag表位的表达。图3A显示了特异性细胞表面染色，其使用用MINGAG构建体转染的HEK-293T培养物中Gag+细胞的两种抗MPER抗体10E8和2F5。GAG转染细胞中缺少MPER细胞表面染色，表明MINGAG蛋白被适当地表达并且到达了细胞表面。在细胞裂解物的蛋白质印迹分析中实现了适当表达的进一步确认，显示出分别在MINGAG和Gag转染细胞中表观分子量为65kDa和57kDa的抗gag抗体所识别的主要蛋白质的表达。当用2F5抗体显示揭示，revealed时，同样的裂解物显示了65kDa和第二蛋白。参见图3B。在转染后48小时，在所收集的清澈上清液中通过ELISA来评价转染细胞的VLP释放。虽然关于MINGAG构建物的VLP产生比关于裸VLP的低8倍，但是两种蛋白质都显示出相似水平的颗粒材料，表明适当粒子产生。参见图3C。通过Nanosight对粒径的进一步表征显示出相似的平均直径：对于裸VLP是160+-40nm以及对于MINGAGVLP是170+-50nm四次实验的平均+-SD。参见图3D。实施例3小鼠中VLP-Gag和VLP-MINGAG的免疫原性在C57BL6小鼠中测试MINGAGVLP的免疫原性。在具有或不具有作为佐剂的磷酸铝的情况下，每组五只动物用200μL裸或MINGAGVLP的制剂注射。制备免疫原，维持组之间相同的Gag抗原浓度，其中唯一区别在于MINGAGVLP中存在或不存在MIN片段。因此，所有动物都被用四剂量以3周间隔32nggag抗原注射。抗gp41IgG应答的时间进程使用MIN抗原测量在两个MINGAG免疫组中都显示高的和特异性免疫原性，其中在被用佐剂adjuvanted的动物中诱发较快，但在仅用VLP免疫的动物中最终水平更高。参见图4A。相反地，抗p24-GagIgG在用裸或MINGAG-VLP免疫的动物中相似，而在两组被用佐剂的动物中更高。参见图4B。测试了佐剂对抗Gag应答的增强作用和对抗gp41应答的抑制作用是否可归因于对VLP结构的不期望的作用。电子显微镜学分析显示磷酸铝处理的VLP失去天然结构，表明GAG含量的释放可以解释这些结果。参见图4C。这些结果表明MINGAGVLP的制剂具有免疫原性，因为用该制剂免疫的动物中的一些可具有mount强IgG应答。然而，在获自对照或免疫动物的血清和纯化的IgG两者中都未观察到针对两种实验室改编的adapted病毒即NL43和BaL的显著的中和活性。参见图4D。为了增加对我们的MINGAG蛋白的MPER的应答，设计了第二免疫程序，其中在佐剂不存在的情况下在VLP免疫如同上述免疫方案之前用偶联至KLH的MPER肽免疫动物每三周四剂量。再次，所有动物都显示出相似的抗Gag应答，而只有MINGAG免疫的动物显示出强的抗gp41IgG应答。参见图5A。抗gp41IgG应答的图谱显示出两个主要的免疫原性区，其中一个涵盖HR2区，而在MPER序列中的另一个与2F5表位重叠。参见图5B。一致地，相比于对照小鼠，在来自MINGAGVLP免疫的动物的血清中观察到低却显著的中和活性。参见图5C。观察到针对HIV的BaL、AC10和SVBP16分离物所有亚型B的中和，并且中和由免疫特异性诱发，因为其被保持在血清的IgG部分中并且在免疫前血清中不存在。实施例4兔中VLP-Gag和VLP-MINGAG的免疫原性使用与实施例3类似的方法以在兔中测试MINGAGVLP的免疫原性。在佐剂不存在的情况下注射VLP两剂量MINGAGVLP并且动物用gag和envDNA接触抗原。所有动物都产生显著的映射到免疫原蛋白的HR2和MPER序列的抗gp41IgG应答如通过T-20肽和C34肽测量的，其中一些与2F5中和表位重叠。参见图6A和6B。再次，相比于对照兔，在来自MINGAGVLP免疫的动物的血清中观察到低却显著的中和活性。观察到针对NL4-3分离物的中和，中和被保持在IgG部分中并且是特异性的，因为未检测到针对VSV假型pseudotyped病毒的明显活性。参见图6C。实施例5密码子优化增加VLP生成在pcDNA3.1载体中克隆编码GAG蛋白和MINGAG融合蛋白的密码子优化cop版本的核苷酸序列，以产生质粒pcDNA3.1GAGcop和pcDNA3.1MINGAGcop。用原始pcDNA3.1MINGAG-3.7和新的密码子优化的pcDNA3.1MINGAGcop进行的HEK-293T细胞瞬时转染导致密码子优化版本的显著更高表达。参见图7。GAG和MPER两者的表达水平高于密码子优化版本5至10倍。实施例6小鼠中编码MINGAGcop的DNA序列具有免疫原性密码子优化的MINGAGcop融合蛋白的较高表达导致在鼠类模型中探索裸DNA的免疫原性。构建编码MINGAG融合蛋白、GAG蛋白的pVaxTM表达载体ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA和空pVax载体，利用EndoFreePlasmidGiga试剂盒QiagenNV,Venlo,NL纯化并注射给C57BL6小鼠。每组五只动物用100μg每种质粒以3周间隔进行四次注射。抗gp41IgG应答的时间进程使用MIN抗原测量显示出唯一地在pVaxMINGAGcop免疫组中的特异性免疫原性。参见图8。相反地，在用pVAXGAGcop和pVaxMINGAGcop免疫的动物中检测到抗p24-GagIgG。参见图8。总而言之，这些数据表明DNA接种诱导了能够诱发体液应答的GAG和MINGAG体内表达。实施例7接头序列与抗原性相关根据本发明的融合蛋白的一般结构包括在TM和GAG序列之间的小接头区。评价该小接头序列中的变化是否影响VLP的表达和生成。为了解决这个问题，产生了不同版本的密码子优化的pcDNA3.1MINGAGcop：包含GGGSSEQID：12、无接头、丙氨酸谷氨酸和赖氨酸接头SEQIDNO：27或丙氨酸脯氨酸接头SEQIDNO：28序列。参见图9。结果显示gp41的三种不同表位由抗体2F5、4E10和10E8限定的表面表达受到接头序列的显著影响。参见Fig9A。接头GGGSG3S展现4E10和10E8抗原性位点的最高表达水平。有趣的是，注意到对VLP生成水平如通过培养上清液中GAG含量测量的没有显著影响。参见图9B。实施例8TM序列与抗原性和生成相关类似地，通过用以下来替换HIV的TM区分析TM序列的作用：a人CD22分子的TM区SEQIDNO：18，b人CD36分子的TM区SEQIDNO：19，c人CD44分子的TM区SEQIDNO：20或dHIV-1Env的R696A突变体SEQIDNO：31。评价表位2F5、4E10和10E8的表达以及VLP的生成。不同TM序列强烈影响相关MPER表位的暴露。相比于野生型gp41TM，CD22和CD36序列显著降低抗原性位点主要是4E10和10E8表位的表达，而CD44TM和突变的gp41TM序列两者都极大地增强表位暴露。观察到该影响对于4E10抗原性位点是特异性的，表明后者构建物提供了比野生型MINGAGcop构建物更好且更均衡的MPER暴露。参见图10A。此外，当VLP的生成被评价和与野生型MINGAGcop构建物相比较时，CD22、CD36和CD44构建物对VLP回收没有影响，而观察到对于突变的gp41TM序列的显著更高的得率，其生成相比关于MINGAGcop参考所观察到的生成高1.5倍。参见图10B。实施例9基于自包装GAG的VLP可与异源小表位一起移入为了证明MINGAG融合蛋白暴露不同表位的能力，HCVE2蛋白的中和表位被移入MIN的胞外部分。MINGAGcop的2F5表位gp41的氨基酸655-667被对应于HCVE2序列的氨基酸408-421的肽KQNIQLINTNGSWH替换，从而产生MINHCVGAG嵌合蛋白。核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体中并在HEK-293T细胞中表达。图11A显示了转染细胞中GAG和HCV共同表达，证明了表位暴露。此外，当4E10和10E8表位对应于MPER的C末端部分被适当暴露时，gp412F5表位不存在。因此，基于MINGAG的VLP可用于以高密度将小表位暴露在其表面。HCV表位移入到MINGAGcopVLP上不改变转染细胞的上清液上VLP的回收。参见图11B。实施例10基于自包装GAG的VLP的多功能性：调节accommodation不同信号肽、大抗原和TM序列证明了基于GAG的融合蛋白的外部免疫原性部分对于调节不同于HIV的抗原的能力。选择了涉及极不相同的病理学的若干抗原：iHCV外部蛋白被选择作为病毒性非HIV的感染的实例。包含HCVE2序列的若干片段——包括膜近侧七残基重复序列和突变的HCVE2TM区——的嵌合蛋白被构建并融合至HIV-1GAG，以产生序列优化的HCVE2GAGcop融合蛋白SEQIDNO：33。ii细菌伯氏疏螺旋体菌ATCC35210B31CIP102532DSM4680株的外表面蛋白AOspA,uniprotP0CL66——莱姆病的病原学因素etiologicagent。ospA信号肽序列残基1-16被人T细胞免疫球蛋白粘蛋白受体TIM-3UniprotQ8TDQ0信号肽替换并融合至ospA氨基酸17-273，该构建物位于CD44TM之前，从而产生序列优化的ospAGAGcop融合蛋白SEQIDNO：37。iii人T细胞免疫球蛋白粘蛋白受体TIM-3蛋白UniprotQ8TDQ0。TIM-3是检查点免疫调节剂家族的成员并且涉及对病原体和肿瘤的T细胞应答。人TIM_3序列的胞外区和TM区位于GAG序列之前，从而产生序列优化的TIM-3GAGcop融合蛋白SEQIDNO：39。图12A中显示了这些构建物的图。三种构建物全部被克隆到pcDNA3.1载体中并转染到HEK-293T细胞中。通过流式细胞术分析胞内GAG和细胞表面表达的免疫原性序列。图12B显示所有所选抗原的表达都与关于原始MINGAGcop构建物所观察到的表达相当。图12C显示携带不同抗原的所有VLP的生成都与MINGAGcopVLP的生成相似或高于MINGAGcopVLP的生成。

权利要求：1.融合蛋白，其从N端到C端包含：a目标多肽，或其功能等同变体，b跨膜结构域，或其功能等同变体，和cHIVgag多肽，或其功能等同变体。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述目标多肽、跨膜结构域和HIVgag多肽、或它们的功能等同变体通过接头、或其功能等同变体连接。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述目标多肽是免疫原性的。4.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述HIVgag多肽、或其功能等同变体缺少豆蔻酰化序列。5.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头包含甘氨酸残基，优选地，所述接头包含甘氨酸残基和丝氨酸残基，更优选地，所述接头包含三个甘氨酸残基和一个丝氨酸残基，甚至更优选地，所述接头包含序列SEQIDNO：24或SEQIDNO：25。6.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述跨膜结构域包含a以下的跨膜结构域：iHIVgp41多肽，ii人CD22分子，ii人CD36分子，或iv人CD44分子；bHIV-1Env的R696A突变体；，或ca和b的功能等同变体。7.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述目标多肽包含来自病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫、变应原或肿瘤标记物中的至少一种多肽或其功能等同变体。8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述病毒是HIV。9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述目标多肽源自HIVenv蛋白或HIVenv蛋白的加工导致的产物，优选地所述HIVenv蛋白是HIVgp41。10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述目标多肽从N端到C端包含：aHIVgp41多肽或其功能等同变体的七残基重复序列2，和b所述HIVgp41多肽或其功能等同变体的膜近侧外部区。11.根据权利要求10所述的融合蛋白，其包含序列SEQIDNO：29。12.多核苷酸，其编码根据权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白。13.根据权利要求12所述的多核苷酸，其包含序列SEQIDNO：9。14.根据权利要求12所述的多核苷酸，其序列被密码子优化用于在人类、伴侣动物或农场动物中表达。15.载体，其包含根据权利要求12至14中任一项所述的多核苷酸。16.宿主细胞，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求12至14中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求15所述的载体。17.用于制备装载有目标多肽的病毒样颗粒的方法，其包括步骤：a在细胞中使根据权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白表达和b从胞外培养基回收VLP。18.病毒样颗粒，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的或使用权利要求17中限定的方法获得的融合蛋白。19.药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求12至14中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求15所述的载体、根据权利要求16所述的宿主细胞或根据权利要求18所述的病毒样颗粒。20.免疫原性组合物或疫苗组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求18所述的病毒样颗粒。21.根据权利要求20所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中组合物基本不含有磷酸铝。22.用于医学中用途的根据权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求12至14中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求15所述的载体、根据权利要求16所述的宿主细胞、根据权利要求18所述的病毒样颗粒、根据权利要求19所述的药物组合物或根据权利要求20至21中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物。23.用于治疗或预防受试者中由病原体或肿瘤引起的疾病的用途的根据权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求12至14中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求15所述的载体、根据权利要求16所述的宿主细胞、根据权利要求18所述的病毒样颗粒、根据权利要求19所述的药物组合物或根据权利要求20至21中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中所述病原体或肿瘤包含所述目标多肽或其区域，优选地所述目标多肽是HIV多肽和感染是HIV感染，和更优选地所述HIV多肽包含gp41或其功能等同变体的所述膜近侧外部区。24.用于根据权利要求22至23中任一项所述的用途的所述融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、病毒样颗粒、药物组合物、免疫原性组合物或疫苗组合物，其中所述受试者被用包含形成偶联至载体的所述融合蛋白的部分的所述目标多肽的缀合物预先治疗，优选地所述载体是KLH。

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