申请/专利权人：浙江清肽生物科技有限公司;浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司

申请日：2021-12-03

公开（公告）日：2024-04-23

公开（公告）号：CN114107355B

主分类号：C12N15/70

分类号：C12N15/70;C12N15/53;C12N9/04;C12N1/21;C12Q1/32;C12R1/19

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.23#授权;2022.03.18#实质审查的生效;2022.03.01#公开

摘要：本发明公开的是一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法及其应用，通过将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta，获得了一株能高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌，使用甘油替代葡萄糖作为碳源有效减少乙酸的积累，通过调整补料速度并将转速与溶氧相关联的方法有效的将溶氧控制在30％左右，从而使得葡萄糖脱氢酶的酶活达到了7211.5Ug，湿重达到了0.2gmL，且发酵液室温放置24h之后，酶活依然保持在86.7％以上，稳定性较好，适合葡萄糖脱氢酶大规模工业化生产。

主权项：1.一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法，其特征在于该方法包括如下步骤：步骤1）获得原始基因GDH；步骤2）根据氨基酸序列设计优化其编码核苷酸序列，全基因合成质粒PET-14b-GDH，所述质粒的序列如SEQIDNO1所示；步骤3）将构建好的质粒PET-14b-GDH热激转化大肠杆菌Rosetta（DE3），转化pET1-4b-GDH后，培养基培养，获得高效表达GDH的工程菌；步骤4）诱导表达工程菌后获得菌液，再进行蛋白表达检测；步骤5）蛋白纯化：将菌液离心集菌后，超声破碎，收集破碎后上清；上清利用镍柱亲和层析；超滤脱盐，冻干保存；步骤3）具体为：将大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞冰浴10min后，加入质粒PET-14b-GDH，冰浴20min；在42℃条件下水浴热激90s，迅速冰浴5min，然后加入LB液体培养基1mL，在37℃条件下培养1h后，5000rpm离心5min，弃900µL上清液，重悬后涂布到Amp抗性的LB固体培养基上；在37℃条件下培养过夜后挑取单菌落，并PCR鉴定正确；诱导表达工程菌具体为：吸取50µL菌种转接到5mL的LB培养基，在37℃，220rpm条件下培养12h以活化菌种，将活化的菌种按照1%的接种量转接到300mL的LB培养基，在37℃，220rpm条件下培养12h得到种子液；向10L发酵罐中加入2.76L微量盐，121℃灭菌20min，向发酵罐中加入240mL补料培养基，调节培养pH值为7，罐温为37℃，接入一级种子液并加入消泡剂，控制通气量为600Lh，罐压为0.1-0.12MPa，转速与溶氧关联，开始培养；设置溶氧大于30%并延时监测2h后开始补料，当培养至OD60时，加入终浓度为0.5mM的IPTG开始诱导，多次取样称量湿重，诱导后下罐，再次取样称量湿重；蛋白表达检测具体为：分别在诱导后1h、5h及下罐后取样，在各样品中分别取0.1g菌体，用1mLPBS重悬，200W，持续3s，间隔3s，超声至溶液澄清；在12000rpm，4℃离心2min取上清，稀释10倍后进行SDS-PAGE凝胶电泳检测。

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