申请/专利权人：中国食品药品检定研究院

申请日：2016-12-28

公开（公告）日：2024-03-26

公开（公告）号：CN106884017B

主分类号：C12N15/41

分类号：C12N15/41;C12N15/65;C12N15/85;C12N7/01;G01N33/569

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.26#授权;2017.07.18#实质审查的生效;2017.06.23#公开

摘要：本发明涉及用于包装柯萨奇病毒B5假病毒的重组表达质粒、假病毒、试剂盒和方法。包装柯萨奇病毒B5假病毒的重组表达质粒，pEGFP‑CV‑B5417质粒表达的CV‑B5结构蛋白在细胞中可以包装pCVB3‑复制子转录的CV‑B3亚基因组RNA，产生的假病毒可以用来检测中和抗体。本发明公开了一种安全，灵敏，快速，特异，简便且成本低廉的检测CV‑B5中和抗体的方法。本发明非常适合于快速，大规模地检测中和抗体的试验，对于病毒疫苗的研制及检测患者个体及人群CV‑B5特异性中和抗体水平有着重要的应用价值。

主权项：1.一种假病毒，其特征在于，由重组表达质粒pEGFP-CV-B5417表达的柯萨奇病毒B5结构蛋白和重组表达质粒pCVB3-复制子转录的CV-B3亚基因组RNA组装而成；所述重组表达质粒pEGFP-CV-B5417使用绿色荧光蛋白报告基因，且含有融合基因I，所述融合基因I是通过将绿色荧光蛋白EGFP的基因序列与CV-B5417所有结构蛋白的基因序列拼接，并将2A蛋白酶的酶切位点插入EGFP基因的C末端拼接得到，所述融合基因I的核苷酸序列为SEQIDNO：3；所述重组表达质粒pCVB3-复制子的报告基因为萤火虫荧光素酶报告基因，且含有融合基因II，所述融合基因II是通过将CV-B3Nancy的5’UTR，荧光素酶基因和CV-B3基因组的非结构蛋白基因及其之后的序列用重叠PCR方法拼接，得到，所述融合基因II的核苷酸序列为SEQIDNO：4；所述SEQIDNO：3第1位到717位为绿色荧光蛋白的编码基因；第718位到732位为肠道病毒的2A蛋白酶的识别位点；第733位到3282位为CV-B5417所有结构蛋白的编码基因，编码由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述SEQIDNO：4第1位到742位为CV-B3Nancy的5’UTR核苷酸序列；第743位到2392位为荧光素酶基因的核苷酸序列，第2393位到2410位为2A蛋白酶的识别位点；第2411位到6520位为CV-B3Nancy非结构蛋白的编码基因；所述重组表达质粒pCVB3-复制子中在融合基因II的5’UTR前引入T7promoter的序列。

全文数据：用于包装柯萨奇病毒B5假病毒的重组表达质粒、假病毒、试剂盒和方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，涉及检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的方法及其专用假病毒，具体涉及用于包装柯萨奇病毒B5假病毒的重组表达质粒、制备该质粒的方法、假病毒及快速检测试剂盒。背景技术[0002]柯萨奇病毒Coxsackievirus,CoxV是一种人类疾病严重的致病病原，其感染可以导致许多疾病，从较轻的呼吸道感染疾病，到比较严重的心肌炎、心包炎及神经系统的一些疾病，甚至可以引起婴幼儿死亡。基因组全长为7389〜7402个核苷酸。柯萨奇病毒可以分为A、B两组，A组有24型病毒，B组有6型病毒。[0003]柯萨奇病毒13组5型（CoxsakievirusB5，CV_B5属于小核糖核酸病毒Picornaviridae，肠道病毒属EnterovirusXV-B5为单股正链RNA病毒，病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，直径24〜30nm，无包膜和突起。CV-B5基因组全长约7400bp，基因组仅有一个开放阅读框及2个非编码区（5’-UTR和3’-UTR构成。开放阅读框编码含2185个氨基酸的多聚蛋白，该蛋白被病毒自身编码的蛋白酶进一步水解为3个前体蛋白（P1、P2、P3，其中P1前体蛋白编码4个病毒衣壳蛋白（VP1〜4，P2和P3编码7个非结构蛋白（2A〜2C和3A〜3DXV-B5感染后引起的轻症包括上呼吸道感染、腹泻以及手足口病等，也可引起病毒性脑炎、无菌性脑膜炎、胰腺炎、弛缓性麻痹、扩张性心肌炎以及糖尿病等多种重症疾病，CV-B5感染也为导致胰岛素依赖型（I型糖尿病的主要诱发因素之一姚昕，卞莲莲，毛群颖等.柯萨奇病毒B组5型研究进展[J].国际生物制品学杂志，2015，385:234-238.。此外还有文献报道，CV-B5感染可引起短暂性失语症和小儿急性横贯型脊髓炎等罕见临床症状。CV-B5与多起世界范围的病毒性脑炎爆发有关姚昕，卞莲莲，毛群颖等.柯萨奇病毒B组5型研究进展[1].国际生物制品学杂志，2015,385:234-238.。中和抗体的检测对〇^5流行病学调查研究以及疫苗研发评价有很重要意义。[0004]目前比较常用的检测中和抗体效价的方法有三大类:病毒中和试验，酶标记检测方法，抗原-抗体间接凝集抑制试验。（Englishreference:Stanley，Plotkin，WalterOrenstein,PaulOffit；Vaccines,Fifthedition；poliovirusvaccineinactivated,IPVPage618-19;查锦芬，肖长义，佐满珍;疫苗中和抗体体外检测方法的研究进展；中国医药生物技术2008年10月第3卷第5期;374-377页）。[0005]病毒的中和试验是一种以比较病毒受血清中和后残存的感染力为依据，进而判定免疫血清中和病毒能力的方法。早期的病毒中和试验用动物接种，检测病毒感染后血清中残留病毒的感染力，现在已全部被细胞水平的中和试验代替。此类方法均以判定残留的病毒感染力作为标准，主要包括以下几种方法:1.细胞病变中和试验。通过观察中和抗体中和病毒后的细胞病变程度来判定血清中和抗体的水平。但是观察到细胞病变需要时间较长，且受观察者主观因素的影响较大，并且很难根据细胞病变的程度对于中和抗体的活性给出一个定量的评估。2.斑点减少中和试验。正常细胞代谢时会摄入活性染料，但是在病毒感染导致细胞死亡时，细胞会丧失该能力，从而形成无色的噬斑。所以，如果病毒被中和，病毒感染导致的噬斑就会减少。与细胞病变一样，产生噬斑的时间也较长，因而根据其数量的变化从而判断残存的感染力同样也需要较长时间，而且受观察者主观因素的影响较大。3.快速焚光灶抑制试验rapidfluorescentfocusinhibitiontest，RFFIT。将一定量的病毒与系列稀释的待测血清在体外中和后，加入敏感细胞孵育，最后用荧光标记的针对病毒衣壳蛋白的抗体染色，以检测未被抗体中和的残余病毒量荧光灶），最后与病毒对照组相比较，可以算出各种待测血清降低病毒的荧光灶50%的稀释度。最后与已知中和抗体滴度的参照血清比较，最终算出每种待测血清的中和抗体滴度（SirkkaVene，MatsHaglund，AkeLundkvist,LarsLindquist,MarianneForsgren；Studyoftheserologicalresponseaftervaccinationagainsttick-borneencephalitisinSweden；Vaccine252007366-372。病毒中和试验是WHO规定的目前检测中和抗体的参考方法，但该试验不仅耗时，而且由于试验中多使用活病毒，所以还需要相应的生物安全设备。试验对技术人员操作的要求高，成本也较昂贵，不适合大规模的筛选试验。此外，活病毒的传代易造成病原漂变，不利于试验的均一,性。[0006]酶标记检测方法可用于大量快速的中和抗体的定量检测。主要的酶标记检测方法有：1.ELISA方法。ELISA方法既简单不需要特殊的试验设备又安全不需要活病毒）、可快速，定量检测抗体。Muhamuda等利用小鼠中和性单克隆抗体和人体免疫后血清抗体之间的竞争性建立了竞争性ELISA卿C-ELISA方法检测狂犬病疫苗中和抗体，增加了ELISA方法的特异性（KaderMuhamuda,ShampurNarayanMadhusudana*,VasanthapuramRavi；DevelopmentandevaluationofacompetitiveELISAforestimationofrabiesneutralizingantibodiesafterpost-exposurerabiesvaccinationinhumans；InternationalJournalofInfectiousDiseases200711,441一445。2.中和组织培养酶联免疫测定法。2005年，Eyal等（OsnatEyal,UdyOlshevsky,ShlomoLustig,NirParan，MenachemHalevy,PaulaSchneider,GilZomber,PinhasFuchs；Developmentofatissue-culture-basedenzyme-immunoassaymethodforthequantitationofanti-vaccinia-neutralizingantibodiesinhumansera；JournalofVirologicalMethods130200515-21提出了一个灵敏、可重复性高且快速的用来检测抗牛痘病毒中和抗体的中和组织培养酶联免疫测定方法（neutralizationtissue-cultureenzymeimmunoassay，NTC-EIA。该方法的主要步骤为：用连续不同稀释度的血清中和一定量的牛痘病毒，再感染敏感细胞。最后再用ELISA方法测定残余病毒的量。3.酶联免疫斑点enzyme-linkedimmunospot，ELISP0T〇Abai等（AnnaMariaAbai，LarryR.Smith,MaryK.Wloch;JournalofImmunologicalMethods322200782-93用ELISP0T的方法建立了适合在临床上评估HCMV疫苗效价的一种高通量微量中和试验方法。酶标记检测类的方法中ELISA的方法虽然有诸多优点，但是使用病毒的糖蛋白做ELISA检测，其结果与病毒中和试验的一致性欠佳。而其他相关性较高的酶标记检测方法则需要用到活病毒，这对技术人员的操作和安全设备要求比较高。此外，活病毒的传代易造成病原漂变，不利于试验的均一性。[0007]抗原-抗体间接凝集抑制试验利用抗原与抗体混合后不能再与致敏颗粒结合，因此不会出现凝集现象的原理检测中和抗体的滴度。Stephenson等（IainStephenson,RoseGainesDas,JohnM.Wood,JacquelineM.Katz；ComparisonofneutralisingantibodyassaysfordetectionofantibodytoinfluenzaAH3N2viruses:Aninternationalcollaborativestudy;Vaccine2520074056-4063比较了用于检测抗流感病毒中和抗体的HIhaemagglutinininhibition试验和病毒中和（virusneutralization,VN试验之间的可重复性，他们分别用这2种方法对8个国家11个试验室的血清样本进行了检测。HI法测定的抗体滴度可重复性较好，而VN法则在敏感性上优于HI法;HI法的另外一个缺点是每次观察凝集现象都必须采用新鲜的血细胞。此外，不是所有病毒的中和抗体都能抑制血凝作用，因此该方法比较适合配合病毒的中和试验一同使用，也不大适合于大规模的中和抗体的筛选试验。[0008]目前，检测中和抗体的方法如活病毒的中和试验多采用完全具有传染性的病毒，此类方法的结果虽然可靠，但是缺点是活病毒在传代过程中易发生抗原漂移，更重要的是在试验操作过程中有危险性，因此对于技术人员的操作和安全设备都要求较高。而其他一些不需要用到活病毒的检测方法也存在各种缺陷。例如与作为标准的病毒中和试验的结果相关性不好ELISA法），操作繁琐抗原-抗体间接凝集抑制试验），成本昂贵快速荧光灶抑制试验），因此不适合大规模的快速筛选。[0009]本发明利用CV-B5的假病毒系统检测中和抗体的方法，采用了单周期感染的假病毒系统，所以没有使用活病毒时的安全问题。该假病毒系统是一种安全，灵敏，快速，特异，简便且成本低廉的检测中和抗体的方法。适合于快速、规模地检测中和抗体的试验，对于病毒疫苗的研制及检测患者个体及人群CV-B5特异性中和抗体水平有着重要的应用价值。发明内容[0010]本发明的一个主要目的是提供用于包装柯萨奇病毒B5CoxsakievirusB5,简称CV-B5假病毒的重组表达质粒、由重组表达质粒组装成的假病毒和由此制备的试剂盒，以及使用该质粒、假病毒或该试剂盒检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的方法。[0011]所述重组表达质粒命名为PEGFP-CV-B5417质粒，表达质粒的氨基酸序列为SEQIDN0:3或在SEQIDN0:3的氨基端和或羧基端添加或缺失若干个氨基酸后得到的与SEQIDN0:3具有相同或相似功能的序列。[0012]pEGFP-CV-B5417质粒使用绿色荧光蛋白报告基因，该报告基因核苷酸序列为SEQIDNO:1所不的DNA序列。图一为肠道病毒基因组不意图。[0013]所述SEQIDN0:3第1位到717位为绿色荧光蛋白的编码基因；第718位到732位为肠道病毒的2A蛋白酶的识别位点；第733位到3282位为CV-B5417所有结构蛋白的编码基因。[0014]本发明的另一个方面，提供一种表达pEGFP-CV-B5417质粒重组蛋白的方法，包含以下步骤：1将绿色荧光蛋白的基因序列与CV-B5417所有结构蛋白的基因序列拼接；2并将2A蛋白酶的酶切位点插入绿色荧光蛋白基因的C末端;3设计引物；[0015]其中，所述引物序列为：[0016]IF-pcDNA6-GFP-F:ACCCAAGCTGGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAG[0017]IF-pcDNA6-CB5[0018]P1-R:GGTGATGATGACCGGTTTAGGTGGTCTGCATAGTTGTTATAT⑶L-GFP-AITTL-R:AAGGGTAGTAATGGCCTTGTACAG[0019]0L-AITTL-CB5P1-F:Gacgagctgtacaaggccattactacccttggagctcaagtatcaacac〇[0020]在一些优选的实施方案中，所述报告基因为绿色荧光蛋白基因；[0021]在另一些实施方案中，所有结构蛋白的编码基因为如下1-3中任一所述的基因：1其核苷酸序列为序列表中序列第733位到3282位所示;2在严格条件下与1所示的基因杂交且编码所述结构蛋白的基因；3与1或2的基因具有90%以上的同源性且编码所述结构蛋白的基因；[0022]本发明的另一个方面，提供一种检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的重组表达质粒，重组表达质粒命名为pCVB3-复制子pCVB3-replicon-fluc，表达质粒的氨基酸序列为SEQIDN0:4或在SEQIDN0:4上添加、缺失或突变若干个氨基酸后得到的与SEQIDN0:4具有相同或相似功能的序列。[0023]所述PCVB3-复制子的报告基因为萤火虫荧光素酶报告基因。[0024]在本发明的一个方面，提供上述结构蛋白重组表达质粒或由此制备的试剂盒在检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的应用。[0025]本发明的另一个方面，提供一种假病毒，PEGFP-CV-B5417质粒表达的CV-B5结构蛋白和PCVB3-复制子转录的CV-B3亚基因组RNA在哺乳动物传代细胞中组装而成的CV-B5重组病毒，假病毒。该假病毒可用于检测肠道柯萨奇病毒B5特异性中和抗体。[0026]本发明提供一种体外的、非诊断性检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的试剂盒，该试剂盒包含上述假病毒。[0027]在一些实施方案中，所述假病毒是将用于包装肠道柯萨奇病毒B5假病毒的重组质粒转染293T细胞中包装得到的重组病毒。[0028]本发明所提供一种检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的方法，包括以下步骤：[0029]将所述假病毒与系列稀释的待测抗体样品（如血清等混合，得到混合物；用所述混合物感染对肠道柯萨奇病毒B5敏感的细胞，根据所述对肠道病毒敏感的细胞中报告基因的表达物所产生的信号定性检测待测样品中是否含有CV-B5特异性中和抗体或定量检测待测抗体样品中CV-B5特异性中和抗体的效价。[0030]含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。[0031]基于以上方案，本发明提供了安全，灵敏，快速，特异，简便且成本低廉的检测中和抗体的方法。由于采用了单周期感染的假病毒，所以没有使用活病毒时的安全问题。中和试验的病毒残余量则对应于进入细胞内的病毒RNA亚基因组删除了结构基因，而代替以荧光素酶基因的病毒基因组在细胞内表达得到荧光素酶的量。向细胞裂解液加入荧光素酶的底物发生化学发光反应后，荧光素酶的量可由化学发光仪精确定量。荧光素酶化学发光反应读数的对数在较大范围内和残留的病毒量有良好的线性关系。试验过程操作简便，对技术人员要求不高。从成本来说，该方法也比较低廉，可以在96孔细胞内进行大规模的筛选试验。[0032]基于以上特点，该假病毒检测系统非常适合于快速，大规模地检测中和抗体的试验，对于病毒疫苗的研制及检测患者个体及人群手足口病、CV-B5特异性中和抗体水平有着重要的应用价值。[0033]本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的主要目的和其它优点可通过在说明书、权利要求书中所特别指出的方案来实现和获得。附图说明[0034]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。[0035]图1示肠道病毒基因组示意图；[0036]图2示单周期感染假病毒示意图；[0037]图3a_3d示定量检测待测血浆中和抗体滴度的结果；[0038]图4示假病毒检测和传统CPE检测方法结果相关性；[0039]图5示CV-B5假病毒做中和试验特异性结果分析；[0040]图6示CV-B5417假病毒系统的线性范围。具体实施方式[0041]下面结合实施例和附图阐释本发明的原理。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为市售。[0042]RD细胞（来源于人横纹肌肉瘤）（购自ATCC，产品目录号为CCL-136™和293T细胞来源于人胚胎肾细胞）（购自ATCC，产品目录号为CRL-11268™在10%FBS胎牛血清，购自GIBC0,产品目录号为10099-141的DMEM中培养。RD细胞为用于检测中和抗体试验的敏感细胞系。293T细胞被用来包装EV71的假病毒。[0043]实施例检测肠道病毒CV-B5的中和抗体[0044]—、定性检测肠道病毒CV-B5的中和抗体的有效性及定量检测肠道病毒CV-B5的中和抗体的效价[0045]1、构建CV-B5结构蛋白表达质粒和CV-B3复制子质粒[0046]1制备CV_B5cDNA[0047]取CV-B5的活病毒CV-B5417JSCHN2013可从中国食品药品检定研究院获得），CV-B5417的RNA用TrizolReagent提取（购自Invitrogen，产品目录号为15596-018。所得的RNA被用作反转录PCR的模板，用RandomPimer购自Takara，产品目录号为3801作为引物，反转录出cDNA。[0048]2构建CV-B5417结构蛋白表达质粒[0049]以反转录出的cDNA为模板，PCR扩增获得CV-B5417的结构蛋白编码区段，并在病毒基因组结构蛋白N’端插入绿色荧光蛋白（EGFP基因。将绿色荧光蛋白（EGFP的基因序列与CV-B5417所有结构蛋白的基因序列拼接，并将2A蛋白酶的酶切位点插入EGFP基因的C末端，拼接得到融合基因1如图2所示），其核苷酸序列如SEQIDN0:3所示。[0050]其中，第1位到717位为绿色荧光蛋白的编码基因；第718位到732位为肠道病毒的2A蛋白酶的识别位点；第733位到3282位为CV-B5417所有结构蛋白的编码基因，编码由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，S卩CV-B5417的所有结构蛋白（如图1所示的VP4、VP2、VP3和VP1表示CV-B5417的所有结构蛋白）。[0051]同时，通过引物在拼接得到DNA片段的5’端和3’端分别引入15bp长度的与NhelAgel双酶切后产生的线性化pCDNA6HisA的载体末端互补的序列。pCDNA6HisA用Nhel购自NewEnglandBioLabs，产品目录号为R0131和Agel购自NewEnglandBioLabs，产品目录号为R0552酶切，然后将插入片段用In-Fusion连接克隆到pCDNA6HisA的载体购自Takara，产品目录号为638909上，得到重组质粒，命名为pEGFP-CV-B5417capsid质粒）。[0052]重组质粒验证方法：[0053]①转化后挑取单克隆，LB摇菌后，进行菌液PCR，提取质粒；[0054]②用Nhel和Agel对重组质粒进行双酶切鉴定；[0055]③挑选酶切图谱正确的克隆送奥科测序公司进行测序。[0056]PCR构建引物如下：[0057][0058][0059][0060][0061][0062]3构建含有表达荧光素酶基因的CV-B3的复制子质粒。[0063]具体方法如下：[0064]CV-B3复制子（CV_B3subgenomicrepliconDNA分子是将柯萨奇病毒13组3型的亚基因组RNA对应的cDNA中的所有结构蛋白的编码基因替换为报告基因得到的重组DNA，DNA分子为SEQIDN0:4中序列第1位到6520位所示的DNA分子。[0065]将CV-B3Nancy的5’UTR，荧光素酶基因和CV-B3基因组的非结构蛋白基因及其之后的序列用重叠PCR方法拼接，得到融合基因II，其核苷酸序列SEQIDN0:4所示，其中第1位到742位为CV-B3Nancy的5’UTR核苷酸序列；第743位到2392位为荧光素酶基因的核苷酸序列。第2393位到2410位为2A蛋白酶的识别位点；第2411位到6520位为CV-B3Nancy非结构蛋白的编码基因；同时在所得到的融合基因II的5’UTR前引入T7promoter的序列（如图2，其中2A、2B、2C、3A和3B表示CV-B3Nancy非结构蛋白基因）。[0066]克隆CV-B3复制子的步骤：[0067]①以CV-B3Nancy全长感染性克隆质粒为模板进行PCR扩增，分别得到CV-B3Nancy的5’UTRUTR，untraslatedregion;非编码区），非结构蛋白基因，3’UTR;以pLuc购自AgilentTechnologies，产品目录号为219087为模板扩增fireflyIuciferase基因。[0068]②将第一步所得到的片段通过PCR拼接起来得到CV-B3Nancy-Flue。[0069]③通过引物再拼接得到CV-B3Nancy-FlueDNA片段的5’端和3’端分别引入15bp长度的与PstI购自NewEnglandBioLabs;产品目录号为R3140Mlul购自NewEnglandBioLabs;产品目录号为R0198双酶切后产生的线性化pSPORTl的载体末端互补的序列，然后用In-Fusion将片段插入PstlMlul双酶切后产生的线性化pSPORTl载体购自Takara，产品目录号为638909上，得到重组质粒。[0070]克隆鉴定方法：①转化后挑取单克隆，LB摇菌后，进行菌液PCR，提取质粒。②用PstI和Mlul对所得重组质粒用酶切鉴定。③挑选酶切图谱正确的单克隆测序。测序结果表明，在pSPORTl载体上插入了序列表所示的DNA序列，说明重组质粒构建正确，将所得的重组质粒命名为pCVB3_replicon-fluc〇[0071]2、DNA的转染与产假病毒[0072]转染前12-14小时在10cm2的细胞培养板上铺293T细胞。[0073]转染当天，293T的密度应该达到80-90%。[0074]转染前一小时，用无抗生素的10%FBS-DMEM购自Invitrogen公司，产品目录号为11965500BT培养293T细胞。用jetPRIME®购自Polyplus，产品目录号为114-15转染10yg三种质粒混合物pEGFP_CV_B5417capsid，pCVB3replicon，pcDNA3.0A_T7polymerase三种质粒等质量混合），在37°C细胞培养箱内培养。[0075]24h后在荧光显微镜下观察EGFP荧光蛋白从而判断结构蛋白的表达水平。48h后，将细胞上清收集到15ml管中，在细胞表面留下约500yl的培养基。用剩余培养基将293T细胞重悬起来，并用干冰反复快速冻融两次。将之前收集的培养基上清和冻融过的沉淀混匀，然后再用离心机2，500g离心15分钟，弃沉淀，收集上清，并分装到1.5ml的EP管中，贮存在-80°C冰箱备用。[0076]操作优点，易于标准化:产生假病毒时，只需要先对293T细胞转染包含了假病毒的结构基因的质粒，然后再转染病毒的RNA复制子。病毒的结构蛋白基因被构建在质粒上，可以在-20°C稳定地贮存。因此，假病毒系统可以克服活病毒在传代过程中易发生抗原漂移的缺点。采用假病毒系统做中和抗体的检测，试验的稳定性高，易于标准化。[0077]3、假病毒的中和试验[0078]在96孔的细胞培养板购自BectonDickinson，产品目录号为353078上接种RD细胞，放在37°C，5%C02的细胞培养箱内培养。接种时，需注意保证细胞均匀的分布在培养板上。感染当天，细胞需达到80%左右的密度。[0079]将待测血清56°C灭活30分钟后，在96孔U形孔板（购自Coming®，产品目录号为3879中用DMEM培养基从1:8到1:2048进行2倍梯度稀释，每个梯度做2-3个复孔，每孔50yl。然后，分别与等体积的CV-B5假病毒混匀，置于37°C孵育1小时。再将混合液悬空加入到100y1的RD细胞5X104cel1swel1中，最终体积为200y1。然后，将96孔板转移到37°CC02培养箱中孵育，孵育后16小时后去掉上清，每孔加入50yl被动细胞裂解液（Promega购自Promega，产品目录号为E1941反复冻融两次裂解细胞，取30yl细胞裂解液，以D-Iuciferin购自BectonDickinson,产品目录号为556678为底物，设置程序后，用化学发光仪购自Berthold，产品名称为CentroLB960检测化学发光反应的读数。然后再加入50ylD-荧光素酶底物，室温避光l〇min。通过荧光测定仪检测确定荧光素酶活性，由光强度表示。每板中同时设置细胞对照、病毒对照、样品对照。[0080]CV-B5417假病毒报告系统可以定量检测样品中抗CV-B5417中和抗体滴度：[0081]待测样品对假病毒的抑制率（％inhibition=100X阴性对照血清组的化学发光读数_待测血清组的化学发光读数阴性对照血清组的化学发光读数。[0082]中和抗体滴度定义为:待测样品对假病毒的抑制率为50%时，待测样品的稀释倍数，即IC50。[0083]将待测血浆用10%FBSDMEM从1:10依次两倍系列稀释至2560倍，并用其对假病毒做中和试验，以得到的抑制率为纵坐标，相应的待测血浆稀释倍数的对数为横坐标作曲线图；由曲线图可以计算出当待测血浆对假病毒的抑制率为50%时，待测血浆的稀释倍数也即该待测血浆的IC50。[0084]定量检测待测血浆含中和抗体滴度的结果如图3a_图3b所示，血浆201图3a、血浆206图3b、血浆216图3c和血浆223图3d均含有抗CV-B5的中和性抗体。计算中和抑制率后对数据进行非现象拟合计算IC50,即可得出在各份血浆样品抗CV-B5中和抗体滴度分别为1904.8、1157.1、332.3和267.5。IC50的数值越高，说明抗体的滴度也越高。以上数据说明该假病毒系统在检测血清中的特异性的中和抗体时，可实现定量检测。[0085]实验相对简便:假病毒的中和试验可以在96孔细胞培养板上进行，每种血清的不同稀释梯度可以做多个复孔，从统计学的角度来讲可以消除孔间差异。假病毒和检测样品的混合物加入细胞培养板后10-20小时，即可将用裂解液裂解细胞，并用排枪取10ul-30ul裂解样品用于化学发光仪的读数。获取数据时，只需要用化学发光仪自动读取荧光素酶化学发光反应的读数即可。化学发光反应所需要的试剂包括裂解液，荧光素酶的底物，荧光素酶的反应缓冲液，成本低廉。因此假病毒系统检测中和抗体方法快速简便而且数据可靠，成本低廉。[0086]单周期感染的优点：假病毒颗粒的包装系统由两部分组成。一个质粒上构建了病毒的结构蛋白基因，另一个质粒上构建了病毒的RNA复制子。CV-B5的假病毒进入细胞时将脱衣壳，并把病毒的复制子RNA释放到细胞内部。复制子的5’末端为核糖体内部进入位点IRES。因此，该元件后的荧光素酶以及非结构蛋白基因都可以被细胞内的核糖体直接翻译。非结构蛋白被翻译后可帮助复制子在细胞内进行复制。假病毒颗粒内的单链正义RNA基因组的结构蛋白基因被删除了，并且为荧光素酶基因所代替。因此，假病毒在单次侵入细胞之后，不能够翻译出结构蛋白，所以无法组装出新的感染性病毒颗粒。假病毒感染系统消除了活病毒首次感染后，重复进入细胞的问题。在同一种细胞系上进行感染试验时，假病毒最终感染细胞所得的荧光素酶化学发光反应的读数只受到病毒颗粒在侵入细胞时受到干扰因素如中和抗体的影响。[0087]二、检验本发明的方法与经典的活病毒中和试验的一致性[0088]平行地用野生型CV-B5活病毒和CV-B5假病毒检测一组人血浆样品的中和抗体滴度。比较双盲试验结果，发现相关性很高。野生型的CV-B5病毒株为CV-B5417JSCHN2013,检定血浆样品来源于健康献血员（来自中国食品药品检定研究院）。对两组检测结果做相关性分析，结果表明假病毒系统在检测病毒中和抗体时与经典的活病毒中和试验有很好的一致性。假病毒检测和传统CPE检测方法结果相关性如图4所示。[0089]三、检验CV-B5假病毒做中和试验[0090]为了检验CV-B5417假病毒系统的特异性，使用小鼠来源的针对CV-B5417的特异性抗血清来自用CV-B5417灭活病毒免疫过的SPF级BALBc小鼠的血清），小鼠来源的针对EV-A71FY的特异性抗血清来自用EV-A71FY灭活病毒免疫过的SPF级BALBc小鼠的血清），小鼠来源的针对CV-B3112的特异性抗血清来自用CV-B3112灭活病毒免疫过的SPF级BALBc小鼠的血清），小鼠来源的针对CV-A16G10的特异性抗血清来自用CV-A16G10灭活病毒免疫过的SPF级BALBc小鼠的血清），小鼠来源的针对CV-A6TW的特异性抗血清来自用CV-A6TW灭活病毒免疫过的SPF级BALBc小鼠的血清和小鼠来源的针对戊型肝炎HEV的特异性抗血清（来自用万泰沧海公司生产的戊型肝炎疫苗免疫过的SPF级BALBc小鼠的血清）（对SPF级BALBc小鼠的眼眶采血所得到的血清，此为常规制法;SPF级BALBc小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司）对CV-B5417假病毒做中和试验。结果如图5所不。[0091]计算抗血清的相对抑制百分率的公式如下：[0092]待测血清对假病毒的抑制率（％inhibition=阴性对照血清组的化学发光读数-待测血清组的化学发光读数阴性对照血清组的化学发光读数。[0093]结果表明CV-B5417的假病毒能够选择性地被CV-B5417的特异中和抗体所中和，但是不能够被其它抗血清中和。因此，CV-B5417的假病毒能够特异性地检测到针对CV-B5417的中和抗体。并且假病毒系统对于检测中和抗体有很高的灵敏度，仅需少量的血清便检测血清中特异的中和抗体。[0094]四、CV-B5417假病毒系统的线性范围[0095]将假病毒原液做系列稀释，感染RD细胞，纵坐标为荧光蛋白素的化学发光反应的读数即相对光单位RLU,relativelightunit的对数值。对数据进行线性回归分析，得到一个假病毒系列稀释感染的趋势图，如图6所示，由图可见，化学发光仪所读出的荧光素酶化学发光反应读数的对数（lgRLU的线性范围为从4.5至8,即RLU的读数在104.5〜108之内。[0096]基于上述实施例，本发明提供了安全，灵敏，快速，特异，简便且成本低廉的检测中和抗体的方法，可以在96孔细胞内进行大规模的筛选试验。产假病毒时，只需要先对293T细胞转染包含了假病毒的结构基因的质粒，然后再转染病毒的RNA复制子。病毒的结构蛋白基因被构建在质粒上，可以在-20°C稳定地贮存。假病毒克服活病毒在传代过程中易发生抗原漂移和操作安全性低等缺点。并且假病毒对于检测中和抗体有很高的灵敏度，仅需少量的血清便检测血清中特异的中和抗体。对于病毒疫苗的研制及检测患者个体及人群CV-B5特异性中和抗体水平有着重要的应用价值。[0097]以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种用于包装柯萨奇病毒B5假病毒的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒命名为PEGFP-CV-B5417质粒，表达质粒的氨基酸序列为SEQIDNO:3或在SEQIDNO:3的氨基端和或羧基端添加或缺失若干个氨基酸后得到的与SEQIDNO:3具有相同或相似功能的序列。2.根据权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于，所述质粒使用绿色荧光蛋白报告基因，氨基酸序列为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于，所述SEQIDN0:3第1位到717位为绿色荧光蛋白的编码基因；第718位到732位为肠道病毒的2A蛋白酶的识别位点；第733位到3282位为CV-B5417所有结构蛋白的编码基因。4.一种表达权利要求1所述pEGFP-CV-B5417质粒的方法，其特征在于，包含以下步骤：1将绿色荧光蛋白的基因序列与CV-B5417所有结构蛋白的基因序列拼接;2并将2A蛋白酶的酶切位点插入绿色荧光蛋白基因的C末端;3设计引物；所述引物序列为：IF-pcDNA6-GFP-F:ACCCAAGCTGGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGIF-pcDNA6-CB5Pl-R:GGTGATGATGACCGGTTTAGGTGGTCTGCATAGTTGTTATATCOL-GFP-AITTL-R:AAGGGTAGTAATGGCCTTGTACAG0L-AITTL-CB5P1-F:Gacgagctgtacaaggccattactacccttggagctcaagtatcaacac〇5.—种用于包装柯萨奇病毒B5假病毒的重组表达质粒，其特征在于，重组表达质粒命名为PCVB3-复制子，表达质粒的核苷酸序列为SEQIDN0:4或在SEQIDN0:4上添加、缺失或突变若干个氨基酸后得到的与SEQIDNO:4具有相同或相似功能的序列。6.根据权利要求5所述的重组表达质粒，其特征在于，所述pCVB3-复制子的报告基因为萤火虫焚光素酶报告基因。7.权利要求1和或5所述的重组表达质粒或由此制备的试剂盒在体外检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的应用。8.—种假病毒，其特征在于，由权利要求1所述的PEGFP-CV-B5417质粒表达的柯萨奇病毒B5结构蛋白和权利要求5所述的pCVB3-复制子转录的CV-B3亚基因组RNA组装而成。9.一种体外的、检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求8所述的假病毒。10.—种检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：1将所述假病毒与系列稀释的待测抗体样品混合，得到混合物；2用所述混合物感染肠道柯萨奇病毒B5敏感的细胞，根据敏感的细胞中报告基因的表达物所产生的信号定性或定量检测待测样品中柯萨奇病毒B5特异性中和抗体的效价。

百度查询： 中国食品药品检定研究院 用于包装柯萨奇病毒B5假病毒的重组表达质粒、假病毒、试剂盒和方法

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