申请/专利权人：云南中医药大学

申请日：2021-06-11

公开（公告）日：2024-03-29

公开（公告）号：CN113508731B

主分类号：A01G22/25

分类号：A01G22/25;A01G24/20;A01G24/15;A01G24/12;A01G24/10;A01G7/06

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.29#授权;2021.11.05#实质审查的生效;2021.10.19#公开

摘要：本发明AMF菌剂为由幼套球囊霉Glomusetunicatum孢子制成的菌剂，通过本发明限定的方法获得的菌剂和接种方法栽培的三七，无论是物理方面的生长，还是化学方面的包括皂苷等活性成分的积累，均获得了良好的效果，值得推广使用。

主权项：1.一种AMF菌剂在促进三七生长和皂苷积累中的应用方法，方法如下：1）实验材料：三七幼苗为采自云南文山苗乡三七实业有限公司规范化种植基地的一年生三七幼苗，所用AMF为幼套球囊霉，要求存在形式为保存于土壤基质中的孢子；其孢子形态已经显微镜镜检确认，所侵染的玉米根系经PCR扩增后确证所用AMF为幼套球囊霉；2）AMF孢子扩繁：由于AMF不能被纯培养，需将从根际土壤中收集的AMF孢子在玉米活体系中进行扩繁；2.1）幼套球囊霉孢子的挑取和形态鉴定方法：将根际土样阴干，准确称取50g于500mL烧杯中；加水至300～350mL，浸泡过夜；磁力搅拌10-20min，得土壤溶液；过20、100、140、200目分样筛，用自来水反复冲洗干净，最后将残留物冲洗到200mL的烧杯中，静置5min，倒入500mL梨形分液漏斗，静置15min；打开底部活塞，排水，剩约40mL，从上口倒入铺有滤纸片的布氏漏斗中，抽滤、冲洗三次；转移至直径9cm培养皿中；解剖镜下观察，根据形态，用解剖针将完整的、健康的孢子、孢子果挑取到洁净湿润滤纸上；幼套球囊霉孢子形态为：孢子圆形或近圆形，淡黄色或黄色，有2层孢壁，未成熟后垣孢子的外壁有完整的连孢菌丝，成熟后脱落；2.2）AMF孢子扩繁方法：扩繁体系为活玉米根系；在半开放式花盆种植模式中完成；栽培基质采用混合土壤基质，具体为，按质量比计，淤泥土:胶泥土:蛭石:石英砂＝4:3:2:1，混匀；采用2段式间隔式湿热灭菌方式，装于花盆中，将经表面消毒的玉米种子栽种于基质中，栽培处理3个月；要求根际土壤中AMF孢子的数量达到30～40g；2.3）幼套球囊霉分子鉴定方法以AMF侵染后的新鲜玉米根系为材料，采取CTAB法提取玉米根系和内生真菌总DNA，作为扩增模板，以真菌扩增通用引物作为反应引物3NDF：5’-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3’；V4_euk_R2：5’-ACGGTATCTAGATCAGTCTTCG-3’，采用2×PfuPCRMasterMix酶进行PCR扩增，反应体系为：PCR扩增程序为预变性：94℃、4min；变性94℃、30s，退火：53℃、40s，延伸：72℃、1min，35个循环；后延伸：72℃、7min；4℃保存；PCR酶为2×PfuPCRMasterMix；之后将扩增产物送生物测序公司进行测序分析，测序结果与NCBIDQ273793聚为一枝，证实侵染玉米根系的AMF为幼套球囊霉；3）组别设计：共设1个处理组；处理组为用幼套球囊霉孢子接种的三七，并在周围播撒三叶草种子，每个处理设10个重复，每个重复含4-5株三七幼苗，即处理组含40-50棵三七；4）接种前预处理：首先准备三七栽培基质，配方为：按质量比计，营养土:深层黄土:蛭石＝5:4:1，混合均匀后，采用2段式间隔式湿热灭菌方式进行灭菌处理，待完全恢复室温后，转移至用75％酒精消毒后的花盆中，每盆700g，保证装填至花盆12～23处，加无菌水完全浸透，放置2晚，备用；之后将三七根部土壤小心处理干净后，用去离子水洗净，喷洒0.01％的苯菌灵来抑制三七根部其他真菌的生长繁殖，之后迅速移至栽培基质中；接种菌剂需提前放入栽培基质中；栽培条件为：白天用遮阳网避光，温度28℃，晚上温度22℃，相对湿度85％～95％；间隔4d浇施1次14Hoagland营养液，Hoagland营养液配方如下：0.6mmolLNH4NO3，1.0mmolLKNO3，0.2mmolLNH4H2PO4，1.2mmolLCaNO32，0.12mmolLMgSO4，1.12×10-2mmolLFe-EDTAII，1.1×10-3mmolLMnCl2，0.6×10-2mmolLH3BO4，1.0×10-4mmolLZnSO4，4×10-5mmolLCuSO4，2.5×10-5mmolLNH46Mo7O24，pH值调整至6.5；5）接种及管理：按上述设计，将AMF接种菌剂提前放置在处理后的栽培基质中，在根系到达以外部位的1-2cm处，每棵三七根系周围放置30g接种菌剂；接种后三七培养条件如上；每两个月取根样1次，采用碱解离-酸性品红染色法检测AMF在三七根内定殖情况，每个处理随机选取10-20段、1-2cm的须根制成片子，采用十字交叉法在光学显微镜下观察、拍照。

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百度查询： 云南中医药大学 一种AMF菌剂的应用

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