申请/专利权人：河南省人民医院

申请日：2021-12-31

公开（公告）日：2024-03-29

公开（公告）号：CN114958908B

主分类号：C12N15/85

分类号：C12N15/85;C12N15/89;C12N15/113;C12N15/12;C12N15/55;A01K67/0276

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.29#授权;2022.09.16#实质审查的生效;2022.08.30#公开

摘要：本发明属于生物工程和基因编辑技术领域，具体涉及一种基于CRISPRCas9构建Ets2基因超级增强子敲除动物模型的方法及其应用。SEts2敲除动物模型的构建方法包括如下步骤：1靶向小鼠SEts2序列gRNA设计：2将步骤1中的一对gRNA与cas9质粒共同注射小鼠胚胎，获得F0代小鼠；3鉴定SEts2基因型，筛选出阳性F0代小鼠；4阳性F0代小鼠与野生型小鼠杂交得到F1代小鼠，F1代杂合小鼠自交获得纯合后代，从而构建得到SEts2基因敲除的动物模型。本发明基于CRISPRCas9技术实现对SEts2的定点敲除，具有操作简单、敲除效率高的优势。

主权项：1.基于CRISPRCas9技术构建Ets2基因超级增强子敲除动物模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）靶向小鼠SEst2调控序列的gRNA设计在SEst2区域两侧相应位置设计一对用于SEts2基因敲除的gRNAgRNA1和gRNA2，其中，gRNA1的序列表为SEQIDNO.1和gRNA2的序列表为SEQIDNO.2；其中，靶向SEst2核苷酸序列位于小鼠Chr16:95721049-95979933之间，gRNA1与gRNA2分别位于靶向SEst2核苷酸序列的上游与下游；2）mRNA制备并显微注射获得F0小鼠将步骤1中的gRNA1和gRNA2进行纯化，将纯化后的产物和cas9质粒共同注射C57小鼠胚胎，注射后将胚胎移植到代孕受体小鼠的输卵管内，原核注射获得胚胎；3）F0代小鼠的出生及鉴定出生小崽，F0代小鼠出生1周后进行剪尾鉴定，得到阳性F0代小鼠，毛色为黑色，阳性F0代小鼠均为雄鼠；用于SEts2基因型鉴定的特异性引物设计方案为，野生型WT与SEts2基因敲除型KO采用共同的上游引物，野生型采用SEts2-seqF作为上游引物，SEts2-seqR1作为下游引物；SEts2基因敲除型采用SEts2-seqF作为上游引物，SEts2-seqR2作为下游引物；SEts2-seqF、SEts2-seqR1和SEts2-seqR2的序列分别为SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5所示；对F0代小鼠出生1周后进行剪尾鉴定的PCR反应，PCR反应体系：2xPCRmix10μL，SEts2-seqF0.5μL；SEts2-seqR1SEts2-seqR20.5μL；模板gDNA1μL；超纯水8μL；PCR反应程序：温度94℃，时间90s,循环1次；温度94℃，时间30s,循环35次；温度68℃，时间30s,循环35次；温度72℃，时间30s,循环35次；温度72℃，时间,90s，循环1次；温度4℃，finished,循环1次；PCR反应后野生型与SEts2基因敲除型中针对SEts2基因的PCR产物大小分别为737bp和935bp，其中对F0代小鼠进行基因型判断的标准为：由SEts2-seqF和SEts2-seqR1进行PCR扩增后获得737bp的产物，而由SEts2-seqF和SEts2-seqR2进行PCR扩增后未获得任何产物，则认定该小鼠为野生型小鼠；当由SEts2-seqF和SEts2-seqR1进行PCR扩增后未获得任何产物，而由SEts2-seqF和SEts2-seqR2进行PCR扩增获得935bp的产物，则认定该小鼠为SEts2基因敲除型；当由SEts2-seqF和SEts2-seqR1进行PCR扩增后获得737bp的产物，而由SEts2-seqF和SEts2-seqR2进行PCR扩增获得935bp的产物，则为杂合型，即阳性F0代小鼠；4阳性F0代小鼠与野生型小鼠杂交得到F1代小鼠，F1代杂合小鼠自交获得纯合后代，从而构建得到SEts2敲除的动物模型。

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