申请/专利权人：山东省大健康精准医疗产业技术研究院

申请日：2021-02-19

公开（公告）日：2024-04-02

公开（公告）号：CN113009135B

主分类号：G01N33/574

分类号：G01N33/574;G01N33/58;G01N33/543;G01N33/535;G01N21/76

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.02#授权;2021.07.09#实质审查的生效;2021.06.22#公开

摘要：本发明涉及一种检测CD47的管式磁微粒化学发光免疫定量试剂盒及其制备方法与应用。所述试剂盒包括磁微粒‑免疫球蛋白结合分子‑CD47抗体复合物、CD47抗体‑中性亲和素‑生物素‑辣根过氧化物酶复合物、样品稀释液、发光液A、发光液B、洗涤剂、CD47标准品梯度溶液、反应管及使用说明书。本发明还提供的管式磁微粒化学发光免疫定量试剂盒的制备方法与应用。本发明将磁性分离技术、化学发光检测技术与免疫学方法三者相结合，得到的式磁微粒化学发光免疫定量试剂盒检测的精密性和稳定性得到极大的提升。并且本发明试剂盒稳定性好，在2～8℃至少可以稳定存放一年。

主权项：1.一种检测CD47的管式磁微粒化学发光免疫定量试剂盒，其特征在于，包括磁微粒复合物、样品稀释液和酶结合物；所述的磁微粒复合物为磁微粒-免疫球蛋白结合分子-CD47抗体复合物；所述的酶结合物为CD47抗体-中性亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物；所述的CD47抗体为CD47单克隆抗体；所述样品稀释液的配方是：除菌的1L纯化水中，含NaCl7~8g，NaH2PO4·2H2O0.15~0.25g，NaH2PO4·2H2O2.5~3.0g，酪蛋白钠盐3.5~4.0g，Proclin3001.0~2.0mL；所述检测CD47的管式磁微粒化学发光免疫定量试剂盒还包括：发光液A、发光液B、20×浓缩洗涤剂、CD47标准品梯度溶液、反应管和使用说明书；所述的磁微粒的结构为：内层为F3O4磁性材料，外层为覆盖F3O4磁性材料的聚合物，微粒总粒径为0.8μm~1.5μm；所述的磁微粒按照如下方法制备：在68~75℃，N2保护下将无水乙醇、H2O、聚乙二醇-6000、F3O4加入到反应器中，快速搅拌0.5~1h；然后将过氧化苯甲酰溶解在苯乙烯中缓慢滴加进反应器中，再依次加丙烯酸，二乙烯基苯，于快速搅拌下恒温反应10~15h后，采用H2O、无水乙醇和稀HCl反复洗涤3~5次，经分离后得到磁微粒；所述的无水乙醇、H2O、聚乙二醇-6000、F3O4、过氧化苯甲酰、苯乙烯、丙烯酸和二乙烯基苯的质量比为（35~40）:（30~34）:（5~6）:（1~2）:（5~6）:（12~15）:（1~2）:（1~2）；所述免疫球蛋白结合分子为葡萄球菌蛋白A；所述发光液A中含有鲁米诺3.5~4.5mmolL，对碘酚0.3~0.8mmolL，FeCl39~30μmolL，二氧六烷1~5mLL，Tris-HCl缓冲液5mmolL，pH8.6，避光保存；所述发光液B为浓度为1~10mmolL的过氧化脲溶液；所述洗涤剂中含有0.3~0.5molL磷酸氢二钠，0.04~0.06molL磷酸二氢钠，2.5~3.5molL氯化钠，8~12mLLTween-20，0.1~0.3mLLProclin300；所述CD47标准品梯度溶液有10个浓度的溶液，以如下方法制得：按照3~5wt%牛血清白蛋白、0.85wt%氯化钠、3~5wt%海藻糖、pH7.3~7.5的1.0mmolLNa2HPO4-NaH2PO4的缓冲液、0.1~0.3mLLProclin300配制标准品稀释液，再用标准品稀释液制备400、200、50、25、5、1、0.5、0.1、0.05、0ngmL10个浓度梯度的CD47标准品溶液，其中0ngmL为标准品稀释液；所述的检测CD47的管式磁微粒化学发光免疫定量试剂盒的制备方法，包括步骤如下：S1：磁微粒-免疫球蛋白结合分子-CD47抗体复合物的制备将400~500μg羧基磁微粒置于在50mM、pH为5的MES缓冲液中，然后添加100~120μg的EDC和100~120μgSulfo-NHS后，室温震动孵育40~45min，离心洗涤后，加80~120μg免疫球蛋白结合分子孵育3~3.5h，再离心洗涤，加入80~120μgCD47单克隆抗体与磁微粒-免疫球蛋白结合分子孵育3~3.5h，得到磁微粒-免疫球蛋白结合分子-CD47抗体复合物；S2：CD47抗体-中性亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物的制备1）CD47抗体-中性亲和素的制备将15~60mg中性亲和素溶解在100mL、0.1molL磷酸盐缓冲液中，加入0.5~0.8mL浓度为0.2mgmL的CD47抗体溶液，再逐滴加50mL浓度为0.1~0.3%戊二醛溶液，避光搅拌16~20h，然后在0.1molL、pH为7.4磷酸钠缓冲液中透析除去戊二醛，透析完成后的溶液中加入等体积的丙三醇，得到CD47抗体-中性亲和素；所述戊二醛溶液由0.1molL、pH为6.8的磷酸钠缓冲液配制；2）生物素标记的辣根过氧化物酶结合物的制备取4~6mg辣根过氧化物酶溶于1mL蒸馏水中，加入体积为0.2mL、质量为4.3mg的过碘酸钠溶液，室温避光搅拌20min，用0.01molL、pH为4.4醋酸缓冲液进行过夜透析提纯后，加入0.1~0.5mg生物素，用0.2molL、pH为9.5碳酸盐缓冲液调pH到8.0~9.0，室温避光振摇2~2.5h，得到生物素标记的辣根过氧化物酶结合物；3）CD47抗体-中性亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物的结合将CD47抗体-中性亲和素用PBS洗涤，加入用PBS稀释10~50倍体积生物素标记的辣根过氧化物酶结合物，在4℃下孵育1~2h，得到CD47抗体-中性亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物；S3：组装将磁微粒-免疫球蛋白结合分子-CD47抗体复合物、CD47抗体-中性亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物、样品稀释液、发光液A、发光液B、洗涤剂、CD47标准品梯度溶液和反应管及使用说明书组装成盒，即得到检测CD47的管式磁微粒化学发光免疫定量试剂盒，储存于2~8℃。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 山东省大健康精准医疗产业技术研究院 一种检测CD47的管式磁微粒化学发光免疫定量试剂盒及其制备方法与应用

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD