申请/专利权人：山东省大健康精准医疗产业技术研究院

申请日：2021-02-19

公开（公告）日：2024-04-02

公开（公告）号：CN113156130B

主分类号：G01N33/58

分类号：G01N33/58;G01N33/577;G01N33/553;G01N33/543

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.02#授权;2021.08.10#实质审查的生效;2021.07.23#公开

摘要：本发明涉及一种检测CD47的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用。本发明的酶联免疫试剂盒，包括碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体、样品稀释液、酶标板、CD47标准品梯度溶液、酶标抗体稀释液、20×浓缩洗涤液、显色剂和终止液。本发明采用了碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体，以碱性磷酸酶标记替代传统辣根过氧化物酶标记，引入了纳米金和双抗辅助抗体抗体，通过多次信号放大方法，显著提高了试剂盒的稳定性和检测灵敏度。另外，碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体引入了价格低廉易获得的辅助抗体aMab2，减少了Mab2的用量，极大地降低生产成本。

主权项：1.一种检测CD47的酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括：碱性磷酸酶标记的纳米金GNP功能化修饰的抗CD47结合物的抗体和样品稀释液；所述碱性磷酸酶标记的纳米金GNP功能化修饰的抗CD47结合物的抗体是CD47单克隆抗体2和碱性磷酸酶标记的β-Actin单克隆抗体aMab2附着于GNP表面组成的组合物aMab2-GNP-Mab2，所述CD47单克隆抗体2简写为Mab2，所述Mab2和aMab2的质量比为0.5-2:2-5；所述碱性磷酸酶标记的纳米金GNP功能化修饰的抗CD47结合物的抗体的制备：首先配置GNP悬浮液，将200mL0.01％HAuCl4·4H2O溶液置于磁力搅拌器搅拌，煮沸3min，然后快速加入6mL1％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌、加热，颜色逐渐无色变为黑色，然后呈透亮酒红色，继续煮沸10min，停止加热，并继续搅拌，冷却至室温，用双蒸水定容至200mL，将GNP悬浮液储存在棕色的瓶子里，避光保存，储存于4℃备用；然后，将50mg的Mab2和aMab2按照0.5-2:2-5的质量比加入到制备好的100mLGNP悬浮液中，轻轻搅拌均匀，静置2h，使得Mab2和aMab2通过相互作用附着在GNP表面；再加入10mL5wt％的BSA溶液，轻轻搅拌均匀，静置30min后，于4℃、12000rmin离心10min，弃上清，底部得到暗红色沉积物即是aMab2-GNP-Mab2，冷却后储存于4℃备用；所述样品稀释液的配方是：以除菌的1000mL纯水计，含NaCl8g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、表面活性剂S93g、酪蛋白钠盐5g、Proclin3001mL；所述检测CD47的酶联免疫试剂盒还包括：酶标板、CD47标准品梯度溶液、酶标抗体稀释液、20×浓缩洗涤液、显色剂和终止液；所述酶标板为96或48孔酶标板，且其各孔包被有CD47单克隆抗体1，所述CD47单克隆抗体1简写为Mab1；所述CD47标准品梯度溶液包括浓度梯度为400ngmL、200ngmL、100ngmL、50ngmL、25ngmL、0ngmL的6个CD47标准品溶液，所述CD47标准品梯度溶液由标准品缓冲液配制得到，所述标准品缓冲液为含5wt％牛血清白蛋白、0.85wt％氯化钠的pH7.0的1.0mmolL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液；所述酶标抗体稀释液的配方是：NaCl8.0gL，NaH2PO4·2H2O0.2gL，Na2HPO4·12H2O2.9gL，新生牛血清200mLL，蔗糖30gL，BSA10gL，PEG200002gL，酪蛋白钠盐1gL，Proclin3001mLL，吐温202mLL，pH为7.4，溶剂为纯化水；所述20×浓缩洗涤液的配方是：以除菌50mL双蒸水计，含NaCl8.0g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、吐温200.5mL；所述显色剂是50mgPNPP、1mgMgCl2·6H2O与10mL二乙醇胺的混合液，pH9.8；所述终止液是浓度为2molL的硫酸溶液。

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