申请/专利权人：天昊基因科技(苏州)有限公司

申请日：2020-07-07

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN113913493B

主分类号：C12Q1/6806

分类号：C12Q1/6806;C12Q1/6813;C12Q1/6869

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.09#授权;2022.01.28#实质审查的生效;2022.01.11#公开

摘要：本发明提供了一种靶基因区域快速富集方法。所述方法采用抗外切核酸酶修饰的延伸引物和或阻滞探针，在引物探针对与样本DNA变性杂交后进行单链核酸特异外切酶酶切纯化，经酶切纯化的产物再通过磁珠纯化、硅胶柱纯化或膜过滤纯化等物理方法二次纯化，然后采用与二代测序平台相匹配的通用引物进行扩增纯化获得测序文库。本发明的方法可以实现多重目的基因片段的快速富集，显著提高靶序列的富集效率，提高目的基因片段的有效读数和测序深度，可以用于各种高通量芯片测序平台如二代测序平台的测序分析。

主权项：1.一种核酸片段的富集方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1提供一反应体系，所述反应体系包括：待测样本、n个探针组；其中，所述n≥2，各个探针组中分别包含第一探针和第二探针；所述第一探针和所述第二探针分别与同一条目标核酸片段的3’端和5’端特异性杂交，所述特异性杂交是指至少部分互补或完全互补；所述第一探针不能被5’-3’方向核酸外切酶降解和或所述第二探针不能被3’-5’方向核酸外切酶降解；所述第一探针包括与目标核酸片段3’端特异性杂交的第一部分和与后续PCR扩增引物序列相对应的第二部分，所述相对应是指所述第二部分的反向互补序列与PCR扩增引物能够特异性杂交；所述第二探针包括与目标核酸片段5’端特异性杂交的第一部分和与后续PCR扩增引物序列特异性杂交的第二部分；当所述第一探针和所述第二探针与同一目标核酸片段特异性杂交时，所述第一探针的3’末端与所述第二探针的5’末端至少间隔1个核苷酸的距离；2对所述反应体系进行高温变性、退火处理，所述第一探针和所述第二探针在高温变性、退火过程中与所述待测样本的目标核酸片段特异性杂交形成杂交产物，从而获得反应混合物I，所述反应混合物I中含有所述杂交产物，其中，高温变性、退火处理的条件为95-100℃2-20min，随后50℃处理0.5-5h；3用一种或多种单链核酸特异外切酶对所述的反应混合物I进行消化处理，从而消化去除未与目标核酸片段杂交的第一探针和第二探针，从而获得经消化的反应混合物II，所述反应混合物II中含有未被消化的所述杂交产物；4对所述反应混合物II进行物理纯化处理，进一步去除残留的未与目标核酸片段杂交的第一探针和第二探针，从而获得经纯化的、含所述杂交产物的反应混合物III；5利用核酸聚合酶和核酸连接酶对所述反应混合物III中的所述杂交产物进行延伸连接反应形成连接产物，从而获得含连接产物的反应混合物IV，并且该步骤中不进行扩增循环；和6以所述反应混合物IV中的连接产物为模板，进行PCR扩增，从而获得PCR扩增产物，即为富集的核酸片段。

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权利要求：

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