申请/专利权人：国科宁波生命与健康产业研究院;中国科学院大学宁波华美医院

申请日：2022-02-07

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN114317689B

主分类号：C12Q1/6844

分类号：C12Q1/6844

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.09#授权;2022.04.29#实质审查的生效;2022.04.12#公开

摘要：本发明公开了非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用。所述方法为：提供一种核酸的步骤，该核酸5’至3’方向依次由F1c、R2、R1、F1、F2、R1c、R2c、F2c区组成，其中F1c区与F1区互补，R2与R2c区互补，R1与R1c区互补，F2与F2c区互补；R1与R2组成R区，F1与F2组成F区；所述核酸的3’端的F2c区与F2区退火，以该核酸为模板合成其自身的互补链，称为核酸A；使用引物第一寡核苷酸与核酸A的Rc区退火，进行合成步骤；所述核酸A的3’端的F1区与临近的F1c区退火，以核酸A为模板合成其自身的互补链，并引发自动的核酸链延伸反应。利用本发明的核酸合成方法，目标片段可仅为40bp左右，且不需要引入外源基因序列。

主权项：1.非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）提供一种核酸的步骤，该核酸5’至3’方向依次由F1c、R2、R1、F1、F2、R1c、R2c、F2c区组成，其中F1c区与F1区互补，R2与R2c区互补，R1与R1c区互补，F2与F2c区互补；R1与R2组成R区，F1与F2组成F区，R1c与R2c组成Rc区；F1c与F2c组成Fc区；2）步骤1）提供的所述核酸的3’端的F2c区与F2区退火，以该核酸为模板合成其自身的互补链，将合成完后的核酸序列称为核酸A；3）使第二寡核苷酸的R区与所述核酸A的Rc区退火，然后以第一寡核苷酸的R区作为合成起点，进行合成步骤；所述第一寡核苷酸包括从5’端到3’端依次为R1区、F1区、F2区；其中所述第二寡核苷酸包括R区与F2区，所述第二寡核苷酸的结构如下所示： ；4）所述核酸A的3’端的F1区与临近的F1c区退火，以核酸A为模板合成其自身的互补链，并引发自动的核酸链延伸反应；所述步骤1）具体的包括以下步骤：1-a）退火步骤，使第一寡核苷酸的F区与模板的Fc区退火，其中所述模板3’至5’方向依次由Fc区和R区组成；所述Fc区包括F1c和F2c区，R区包括R1区和R2区，F区包括F1区和F2区；所述第一寡核苷酸从5’端到3’端依次为R1区、F1区、F2区；1-b）以所述第一寡核苷酸的F2区作为合成起点，合成第一核酸；所述第一核酸具有与所述模板互补的核苷酸序列，所述第一核酸的5’末端具有可与同一条链上的R1c区退火的R1区；1-c）在恒温条件下，使第二寡核苷酸的R区与所述第一核酸的Rc区退火，其中，所述第二寡核苷酸从5’端到3’端依次为F2区、R2区、R1区；所述R区包括R1区和R2区，Rc区包括R1c区和R2c区；1-d）以所述第二寡核苷酸的R1区作为合成起点，合成第二核酸；1-e）在恒温条件下，使第三寡核苷酸的R1区与所述第二核酸的R1c区退火，其中所述第三寡核苷酸从5’端到3’端依次为F1c区、R2区、R1区；1-f）以所述第三寡核苷酸的R1区作为合成起点，合成第三核酸，即获得所述步骤1）中提供的核酸；其中，F区：具有与Fc区互补的核苷酸序列的区；F1区：具有与F1c区互补的核苷酸序列的区；F2区：具有与F2c区互补的核苷酸序列的区；R区：具有与Rc区互补的核苷酸序列的区；R1区：具有与R1c区互补的核苷酸序列的区；R2区：具有与R2c区互补的核苷酸序列的区。

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