申请/专利权人：昭衍(苏州)新药研究中心有限公司

申请日：2022-09-06

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN115219726B

主分类号：G01N33/68

分类号：G01N33/68;G01N33/536;G01N33/58;G01N21/76

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.09#授权;2024.03.15#著录事项变更;2022.11.08#实质审查的生效;2022.10.21#公开

摘要：本发明属于新冠病毒抗体滴度的检测方法，具体地涉及一种使用SARS‑CoV‑2假病毒检测血清中中和抗体滴度的方法，包括以下步骤：1）在检测板设空白对照组，病毒对照组，样品组，设置平行孔；2）对上述的空白对照组，病毒对照组，样品组进行培养后，分别进行发光检测，获得各自发光强度均值；3）计算中和抗体抑制率；4）将上一步算出的中和抗体抑制率采用统计学软件计算出中和抗体滴度；相比现有技术，本发明所述方法克服了现有方法中无法实现细胞层面定量检测血清中中和抗体滴度的缺陷，灵敏度高，并且可以用于不同种属的实验动物，在新冠疫苗的安全性与有效性评价中有较高的实用价值。

主权项：1.一种SARS-CoV-2假病毒检测血清中中和抗体滴度的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）在检测板设空白对照组，病毒对照组，样品组，设置平行孔；2）对上述的空白对照组，病毒对照组，样品组进行培养后，分别进行荧光检测，获得空白对照组发光强度均值、病毒对照组的发光强度均值和样品组的发光强度均值；3）计算中和抗体抑制率＝[1－（样品组的发光强度均值－空白对照组发光强度均值）（病毒对照组的发光强度均值－空白对照组发光强度均值）]×100％；4）将上一步算出的中和抗体抑制率输入统计学软件进行非线性拟合，计算出中和抗体滴度；所述空白对照组中含有hACE2-Cos7细胞；所述病毒对照组中含有SARS-CoV-2假病毒和hACE2-Cos7细胞；所述样品组中含有SARS-CoV-2假病毒、hACE2-Cos7细胞和待测血清；所述发光强度均值由以下步骤测定：31）细胞铺板：D1天在96孔板中每孔接种5000个hACE2-Cos7细胞，37℃培养过夜；32）样品稀释：D1天将待测血清56℃灭活30min，4℃放置过夜，每份40μL；D2天将待测血清做梯度稀释，血清30μL加稀释液570μL，加入24孔板第1列，每孔600μL混匀，后五列每孔加450μL稀释液，排枪将第一列混匀后取150μL加入第二列，依次稀释至第六列弃去150μL；33）中和检测病毒感染：D2从-80℃冰箱中取出SARS-CoV-2假病毒冰上融化，样品组将假病毒与稀释后的血清按当批病毒对目的细胞的感染复数混合，病毒对照组将假病毒与完全培养基混合，37℃孵育1h为混合液；吸去细胞原有培养液，每孔加入100μL配制好的混合液，空白对照组加入100μL完全培养基；轻轻摇匀，4℃，1200g离心感染2h，弃去含有假病毒的培养基，PBS清洗一遍，每孔加入30μL0.25%的胰酶，37℃消化5min,加入100μL完全培养基，排枪轻轻吹打4-5下重悬均匀，37℃培养过夜；34）细胞换液：D3、D4每天更换培养基，在37℃继续培养；35）蛋白表达检测：D5天进行荧光检测，计算发光强度均值；所述步骤35）的荧光检测为Luciferase定量测定；所述Luciferase定量测定包括以下步骤：1）样本处理：PBS洗两次，弃去上清，每孔加入40μL细胞裂解液，冰上裂解15min，裂解过程中间断吹打混悬以充分裂解，转移至1.5mLEP管中，10000g离心3min，取上清用于测定；2）检测方法：取20μL样品加入检测板中，加入100μL已经溶解并平衡至室温的萤火虫荧光素酶检测试剂，适当混匀；震荡后室温孵育5min，使发光信号趋于稳定；使用化学发光检测仪检测520nm光波长下的Luciferase信号值；所述SARS-CoV-2假病毒以HIV病毒为骨架，外面包被SARS-CoV-2的Spike蛋白，能够感染过表达人ACE2的细胞，同时带有FireflyLuc和EGFP标记，通过FireflyLuc和EGFP检测感染效率；所述待测血清来自于经过SARS-CoV-2疫苗免疫后的阳性血清；所述统计学软件为GraphPadPrism中的logagonistvs.response--Variableslope。

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