申请/专利权人：儿童医院医学中心

申请日：2018-03-15

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN110381991B

主分类号：A61K39/00

分类号：A61K39/00;A61K39/12;A61K39/125;A61K39/295;A61P31/14;C07K14/005

优先权：["20170328 US 62/477,481"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.09#授权;2020.02.21#实质审查的生效;2019.10.25#公开

摘要：本文公开了疫苗组合物，特别是用于抗原呈递的多价二十面体组合物。所公开的组合物可含有由重组融合蛋白组成的S颗粒。重组融合蛋白可包括诺罗病毒NoVS结构域蛋白、可操作地连接到诺罗病毒S结构域蛋白的接头蛋白结构域、和可操作地连接到所述接头的抗原蛋白结构域。

主权项：1.一种用于抗原呈递的多价二十面体组合物，其包含S颗粒，其中所述S颗粒包含重组融合蛋白，所述重组融合蛋白由以下组成a修饰的诺罗病毒NoVS结构域蛋白，其中所述诺罗病毒NoVS结构域蛋白的序列是SEQIDNO:25；b可操作地连接到所述修饰的诺罗病毒S结构域蛋白的接头蛋白结构域；和c可操作地连接到所述接头的抗原蛋白结构域；其中所述修饰的诺罗病毒S结构域蛋白包含蛋白酶切割位点的突变，其中所述突变位于第69位或第70位，并且其中所述突变使所述位点对胰蛋白酶切割具有抗性。

全文数据：诺如病毒S颗粒类疫苗及其制备和使用方法交叉引用相关申请本申请要求2017年3月28日提交的美国临时申请62477,481的优先权和权益，其内容以其全部并入并且用于所有目的。关于联邦政府资助研究的声明本发明是在国立卫生研究院授予的R21AI092434-01A1和R56AI114831-01A1至XJ的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。背景技术RV导致严重的急性胃肠炎，主要发生在婴儿和幼儿中，导致每年全球5岁以下儿童中约200,000人死亡、230万人住院以及2400万门诊[25-27]。目前的两种RV疫苗RotaTeqMerck和RotarixGlaxoSmithKline,GSK在许多发达国家都能有效地保护儿童免受严重的RV病例[28,29]。然而，它们在非洲和亚洲的大多数发展中国家都没有表现出令人满意的效果[30-32]，其中RV的感染率、发病率和死亡率大多发生，因此大多需要RV疫苗。发明内容本文公开了疫苗组合物，特别是用于抗原呈递的多价二十面体组合物。所公开的组合物可含有由重组融合蛋白组成的S颗粒。重组融合蛋白可包括诺罗病毒NoVS结构域蛋白、可操作地连接到诺罗病毒S结构域蛋白的接头蛋白结构域、和可操作地连接到所述接头的抗原蛋白结构域。所公开的组合物可用于提供附图说明此申请文件至少包含一个彩色绘图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明目的。附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。图1.天然诺罗病毒NoVS结构域蛋白以低效率组装成颗粒或复合物。AGST-S结构域融合蛋白的表达构建体的示意图，显示凝血酶切割位点和铰链的位置。B和CGST-S融合蛋白GST-S，～51kDaB和游离S蛋白～25kDaC的SDS-PAGE分析。DS蛋白的EM显微照片，显示少量组装的S颗粒箭头。E通过尺寸排阻柱Superdex200对S蛋白进行凝胶过滤色谱的洗脱曲线。通过凝胶过滤校准试剂盒和纯化的重组NoVP颗粒[21,22]、小P颗粒[20]和P二聚体[11]校准凝胶过滤柱。显示蓝色葡聚糖2000～2000kDa，空隙、P颗粒～830kDa、小P颗粒～420kDa、P二聚体～69kDa和抑肽酶～6.5kDa的洗脱位置。F来自两个峰的蛋白质的SDS-PAGE分析，峰1级分#15和16和峰2级分#28和29。在所有SDSPAGE中，泳道M是具有指定分子量的预染色蛋白质标记物。在B、C和F中分别观察到～42和～16kDa的次要S蛋白条带。图2.鉴定S结构域中暴露的蛋白酶位点。A蛋白酶切割的S蛋白的N-末端测序产生五残基序列，NAPGE。BS结构域序列显示相同的五残基序列，NAPGE下划线，表明了蛋白酶切割位点星号。显示了C-末端铰链下划线、四残基接头GGGG和末端融合的Hisx6肽。还显示了该重组S结构域蛋白的计算的分子量。C所有GII诺如病毒的表示之间的序列比对表明蛋白酶位点是高度保守的突出显示位置69和70。D在3倍轴上以不同颜色的卡通表示检查部分GIINoV壳结构W.J.，未发表的数据显示由球形表示中的R69红色-N70青色形成的暴露的蛋白酶位点。左图：俯视图；右图：侧视图。图3.SR69A蛋白和S60颗粒的生产和表征。ASR69A蛋白的表达构建体的示意图，显示铰链、接头GGGG和Hisx6肽标记为H的橙色球。其完整序列显示在图2B中。BSR69A蛋白～25kDa的SDS-PAGE分析。泳道1至5是来自TALONCellThru树脂的洗脱级分。泳道M代表具有指定分子量的预染色蛋白质标记物。CSR69A蛋白的EM显微照片，显示统一尺寸的自组装S60颗粒。D和E通过凝胶过滤色谱法D分析SR69A蛋白质，然后对洗脱峰E进行SDSPAGE分析。D通过尺寸排阻柱Superdex200，10300GL对SR69A蛋白质的凝胶过滤色谱的洗脱曲线。如图1E中所述校准凝胶过滤柱。蓝色葡聚糖2000～2000kDa、P颗粒～830kDa、P二聚体～69kDa和抑肽酶～6.5kDa的洗脱位置分别由x和1、2、3和4表示。E凝胶过滤D中三个主峰的SR69A蛋白的SDS-PAGE分析，其中泳道C在加载到尺寸排阻柱之前是对照SR69A蛋白；泳道M是具有指定分子量的预染色蛋白质标记物；泳道8和9来自峰1的级分#8和9，泳道16来自峰2的级分#16；泳道19来自峰3的级分#19。FSR69A蛋白的电喷雾电离质谱ESI-MS分析。对于80μMSR69A蛋白基于单体的乙酸铵水溶液200mM，pH6.8和25℃以阳离子模式获得的ESI-MS。检测到SR69A结构域单体25.047kDa和二聚体50.095kDa。观察到以mz～15,500为中心的宽特征。尽管质量分辨率不足以建立电荷状态，但是基于报道的大蛋白质复合物的mz[61]估计这些离子的MW约为1.47MDa，对应于60价S60颗粒的MW。图4.基于60价猫杯状病毒VLP的已知晶体结构PDB#：4PB6的S60颗粒的结构建模。A显示S60颗粒的EM显微照片。B至D表面表示中卡通表示B中的SR69A蛋白单体橙色和五C和两倍D轴上的S60颗粒的结构。暴露的C端铰链表面表示以绿色显示。E至G在表面表示中分别地，具有C-末端稠合的接头品红色和Hisx6肽天蓝色在点图示E中的SR69A蛋白单体橙色以及得到的S60颗粒在五F和两倍G轴上的结构。暴露的C-末端铰链、接头和Hisx6肽以点表示显示。图5.表征S60-VP8嵌合颗粒。ASR69A-VP8嵌合蛋白的示意图。轮状病毒的VP8抗原绿色通过接头HHHH与铰链融合。将Hisx6肽橙色与VP8抗原的C末端融合。BSR69A-VP8蛋白～45kDa的SDS-PAGE分析。C通过尺寸排阻柱Superdex200,10300GL对SR69A-VP8蛋白进行凝胶过滤色谱。如图1E所示校准所述柱。蓝色葡聚糖2000～2000kDa、P颗粒～830kDa、P二聚体～69kDa和抑肽酶～6.5kDa的洗脱位置分别用标记为1、2、3和4的x表示。D来自凝胶过滤C的峰1的S60-VP8颗粒的EM显微照片。ESR69A-VP8蛋白的电喷雾电离质谱ESI-MS分析。对于80μMSR69A-VP8蛋白基于单体的乙酸铵水溶液200mM，pH6.8和25℃以阳离子模式获得的ESI-MS。检测到SR69A-VP8单体44.950kDa和降解产物19.990kDa。观察到以mz～23,700为中心的宽特征。虽然质量分辨率不足以确定电荷状态，但这些离子的MW根据报道的大蛋白复合物的mz[61]估算约为3.4MDa，相当于60价SR69A-VP8颗粒的MW。图6.通过引入S结构域间二硫键进一步稳定S60-VP8颗粒。A和BGII.4壳结构的结构分析。A在三维轴上GII.4NoV的部分壳结构W.J.，未发表的数据显示S结构域的V57和Q58分别在空间上接近相邻S结构域的M140'和S136'。六个S结构域以灰色显示卡通图示，而所提及的四个氨基酸以球形表示以不同颜色显示。B一个S结构域的V57红色Q58青色与相邻S结构域的S136'绿色M140'橙色之间的空间关系的特写，距离为5.7至C至ESR69AV57CM140C-VP8蛋白的表征。SEQIDNO31中所示的蛋白质序列CSR69AV57CM140C-VP8蛋白质的表达构建体。DSR69AV57CM140C-VP8蛋白的SDSPAGE分析。泳道1、2、3和4是来自亲和柱的四种洗脱的蛋白质级分。在每个泳道中加载15μl每种级分。M，预染色蛋白标记物。E通过尺寸排阻柱Superdex200,10300GL的SR69AV57CM140C-VP8蛋白的凝胶过滤色谱的洗脱曲线。如图1E中所述校准凝胶过滤柱。蓝色葡聚糖2000～2000kDa、P颗粒～830kDa、P二聚体～69kDa和抑肽酶～6.5kDa的洗脱位置用标记为1、2、3和4的x表示。F至JSR69AV57CQ58CS136C-VP8蛋白的表征。SEQIDNO32中所示的蛋白质序列FSR69AV57CQ58CS136C-VP8蛋白质的表达构建体。GSR69AV57CQ58CS136C-VP8蛋白的SDSPAGE分析。泳道1、2和3是来自亲和柱的三种洗脱的蛋白质级分。每个泳道加载10μl每种级分。H通过尺寸排阻柱Superdex200,10300GL对SR69AV57CQ58CS136C-VP8蛋白进行凝胶过滤分析。如图1E中所述校准凝胶过滤柱。具有不同MW的四种蛋白质的洗脱位置表示为E。I来自凝胶过滤H的峰1的S60-VP8颗粒的EM显微照片。J来自峰1级分#7至10、峰2级分#21和峰3级分#23的蛋白质的SDSPAGE分析。泳道C是加载到柱之前的对照蛋白质。图7.S60-VP8颗粒的结构。A至C通过cryoEM技术重建S60-VP8颗粒的三维结构。AS60-VP8颗粒在五倍轴的表面结构。B和CS60-VP8颗粒的中间切片B和后半部分C的切片结构，显示外部和内部结构。示出了内部S60颗粒S和突出的VP8抗原。显示了基于半径的颜色方案。“5”表示五倍轴。D至F将60价FCV壳结构红色，卡通表示拟合到S60-VP8颗粒的cryoEM密度图透明灰色中。拟合结果由三个透明切片视图显示，显示从正面观察的S60-VP8颗粒的前半部分D、中间切片E和后半部分F。G和H将60个拷贝的P[8]RV的VP8晶体结构PDB代码：2DWR拟合到S60-VP8颗粒cryoEM密度图的突出区域中。S60-VP8颗粒的S60颗粒区域中的拟合FCV壳晶体结构以卡通图示红色示出，而突出区域中的拟合VP8晶体结构以蓝色卡通图示示出。I基于上述拟合结果的S60-VP8颗粒模型。内部S60颗粒以红色卡通图示出，而60个突出的VP8抗原以浅蓝色以点图表示。图8.在CsCl密度梯度离心后，S60-VP8颗粒形成峰。将S60-VP8颗粒加载到CsCl密度梯度上。超速离心后，分别通过对P[8]RVVP8A和GII.4NoVVLPB特异的抗体检测分级梯度中的S60-VP8颗粒。在两种情况下，在梯度的中间检测到S60-VP8颗粒的确定峰。图9.S60颗粒展示的VP8保留了配体结合功能。A聚糖结合测定显示S60-VP8颗粒结合代表H1和Leb抗原但不代表Ley抗原的合成寡糖。没有VP8的S60颗粒不结合三种抗原中的任何一种。图10.S60-VP8颗粒增强了对展示的RVVP8抗原的免疫原性。将相同剂剂量的S60-VP8颗粒、游离VP8抗原和不含VP8的S60颗粒分别免疫小鼠N＝6，然后测量VP8特异性IgG应答A，以及针对RVVP8-配体相互作用的50％阻断效价BT50B和对所得小鼠血清的RV感染的中和活性C。A分别由S60-VP8颗粒、游离VP8抗原和S60颗粒引发的VP8特异性IgG应答。B分别用相同的三种免疫原接种后，小鼠血清对抗RVVP8-配体相互作用的BT50。C分别用相同的三种免疫原免疫后小鼠血清对培养细胞中RV感染的中和活性。数据组之间的统计差异用星号表示*P40mg升细菌培养物和高稳定性图3B纯化。EM观察表明许多环形结构的尺寸统一，代表直径为～22nm的自组装S颗粒图3C。凝胶过滤显示一个主要和两个次要峰图3，D和E，基于他们的MW，它们应分别代表S颗粒1mDa、S二聚体～50kDa和S单体～25kDa，这得到EM观测和ESI-MS分析支持下面。SDS-PAGE通常显示～50kDa的较小条带图3，B和E，其与NoVVLP特异性抗体反应数据未显示，表明它们是在SDS-PAGE分析中未完全变性的S结构域二聚体。这在凝胶过滤色谱的S颗粒级分峰1：级分#8和#9图3，D和E与二聚体峰2：#16和单体峰3：#19级分相比尤为明显。这些数据表明绝大多数SR69A蛋白质组装成统一的S颗粒。将SR68A蛋白自组装成60价S60颗粒。然后申请人进行ESI-MS分析以确定SR69A蛋白的复杂性，揭示三种蛋白形式：125.047kDa的S单体，250.095kDa的S二聚体，和3～1.47mDa的S颗粒图3F。由于计算的重组S结构域蛋白的MW为24585.89道尔顿图2B，因此观察到的自组装S颗粒应为60价，称为S60颗粒。没有观察到大于～1.47mDa的信号的事实表明传统的180价S颗粒没有组装，这与EM观察到的统一粒径图3C一致。通过cryoEM技术对S60-VP8嵌合颗粒的结构重建进一步证实了这些60价S60颗粒图7，见下文。S60颗粒的结构建模。虽然60价NoV衣壳或其内壳的详细结构尚不清楚，但已报道60价猫科动物杯状病毒FCVVLP的晶体结构[59]，提供了一种模拟S60颗粒以了解其结构特征的方法。通过使用60价FCVVLPPDB#：4PB6的晶体结构作为模板来构建S60颗粒的结构模型图4，B至D。模拟的S60颗粒分别在五倍轴或两倍轴显示出略微五边形图4C和六边形图4D的形状。在EM显微照片中的S60颗粒中可以容易地识别这些五边形和六边形形状图4A和图3C。此外，S60颗粒模型可以很好地适应S60-VP8颗粒的cryoEM密度图的S60颗粒区域图7，D到F，支持60价FCV外壳和NoVS60颗粒之间的结构相似性。正如所料，60个C端铰链暴露在每个S60颗粒的表面上图4，B至D，为S60颗粒显示的外来抗原提供了极好的融合点。申请人还使用C-末端接头GGGG和Hisx6肽对S60颗粒进行建模，以模拟S60颗粒的抗原呈递图4，E至G。得到的模型表明60个Hisx6肽显示在每个S60颗粒的表面上，支持了具有C末端连接的Hisx6肽的S60颗粒被Hisx6结合树脂有效纯化的事实图3B。因此，预测来自其他病原体的各种抗原也可以通过将它们融合到S蛋白的暴露的C末端而由S60颗粒展示。S60-VP8嵌合颗粒的生产和表征。为了证明S60颗粒作为抗原呈递增强免疫原性平台的可行性，申请人生产了显示RVVP8蛋白的S60-VP8嵌合颗粒，RVVP8蛋白是主要的RV中和抗原。这通过经由接头将RVVP8蛋白与SR69A蛋白的C末端融合来实现图5A。将Hisx6肽添加到VP8蛋白的C末端用于纯化目的。SR69A-VP8嵌合蛋白～45kDa在大肠杆菌系统中以30mg升细菌培养物的高产率良好表达图5B。SR69A-VP8蛋白的凝胶过滤分析显示三个典型的峰，基于它们的MW，最可能分别代表SR69A-VP8颗粒峰1、二聚体峰2和单体峰3图5C。三个峰的保留比较表明，大约一半的SR69A-VP8蛋白自组装成颗粒峰1与峰2和峰3比较。来自峰1的蛋白质的EM观察显示许多统一尺寸的SR69A-VP8颗粒称为S60-VP8颗粒，其具有可识别的突起，这是由于表面显示VP8蛋白质，导致粗糙表面图5D，其不同于S60颗粒的相对光滑表面图3C和4A。峰1蛋白的ESI-MS分析显示预期的60价S60-VP8颗粒，其MW为～3.4mDa图5E。同样，没有观察到180价颗粒的信号，这与相同蛋白质的显微照片上的S60-VP8颗粒的统一尺寸一致图5D。然而，ESI-MS分析确实揭示了SR69A-VP8蛋白的单体44.950kDa和在19.990kDa处的痕量降解产物，表明S60-VP8颗粒可以分解成单体。S60-VP8颗粒的进一步稳定。SR69A-VP8蛋白质的相对低的颗粒形成效率表明通过增加S颗粒中相邻S结构域之间的分子间相互作用来改善的空间。检查GII.4壳结构W.J.，未发表的数据表明，S结构域的V57和Q58分别在空间上接近相邻S结构域的M140和S136，距离为5.7至5.9图6，A和B。这表明两对残基是引入S结构域间二硫键以进一步增强S60-VP8颗粒形成的良好位置。当SR69A-VP8蛋白的V57和M140突变成半胱氨酸时图6C，S69A58C140C-VP8蛋白在50mg升细菌培养物的极高产率下良好表达图6D。凝胶过滤分析表明，大部分～70％蛋白质组装成S60-VP8颗粒图6E，其通过EM观察证实数据未显示。注意到代表S单体的峰3完全消失，支持二硫键引入后的S结构域间相互作用的增加。当SR69A-VP8蛋白的V57、Q58和S136突变成半胱氨酸时图6F时，S69A57C58C136C-VP8蛋白可以高产率40mg升细菌培养物生产图6G。凝胶过滤分析图6，H和J证明，绝大多数90％S69A57C136C-VP8蛋白自组装成S60-VP8颗粒，这通过EM观察证实图6I。值得注意的是，分别代表S二聚体和单体的峰2和3均消失图6，H和J，这支持了由于S结构域间二硫键导致S60-VP8颗粒形成效率显著增加的观点。申请人还对SR69A-VP8蛋白的所有四种V57、Q58、S136和M140进行了四重半胱氨酸突变，蛋白质产量和S60-VP8颗粒形成效率的结果与S69A57C58C136C-VP8蛋白的类似数据未显示，表明三重半胱氨酸突变足以产生高度稳定的S60-VP8颗粒。S60-VP8颗粒的结构。申请人通过cryo-EM技术参见材料和方法构建了S60-VP8颗粒的三维3-D结构，分辨率为显示出含有60个S-VP8蛋白的T＝1对称性图7。S60-VP8颗粒的表面结构图7A表明，VP8抗原展示在S60-VP8颗粒的表面上，形成从内部S60颗粒延伸的突起。S60-VP8颗粒的中间切片图7B和后半部分图7C的切片结构显示外部VP8抗原青色和部分绿色和内部S60颗粒红色、黄色和部分绿色的结构。可以识别二十面体S60颗粒的五倍轴图7C。S60-VP8嵌合颗粒的直径为～28nm。当将60价FCV壳PDB#：4PB6的晶体结构拟合到S60-VP8颗粒cryoEM密度图的S60-颗粒部分时，两种结构彼此非常吻合图7，D至F。具有S60-VP8颗粒的前半部分图7D、中间切片图7E和后半部分图7F的适合的FCV壳体结构的透明cryoEM密度图证明了FCV60价壳结构和S60-VP8颗粒的NoVS60颗粒区域之间的良好适应性，证实了申请人的S60颗粒图4和S60-VP8颗粒的60价二十面体结构。然后，申请人将60个拷贝的P[8]RVWa株的VP8晶体结构PDB代码：2DWR拟合到S60-VP8颗粒cryoEM密度图的突出区域中图7，G和H。具有拟合的VP8晶体结构的S60-VP8颗粒的前半部分图7G和中间切片图7H的透明cryoEM密度图表明，S60-VP8颗粒的突出区域与60VP8结构之间具有出色的适应性，进一步证实了S60颗粒表面VP8抗原的结构和方向。基于拟合结果，申请人使用60价FCV壳和60VP8P[8]RV的晶体结构制作了S60-VP8颗粒模型图7I。显示VP8的S60颗粒保留了配体结合功能。申请人以前的研究表明，P[8]Rv的VP8结合H1抗原而不是Ley抗原[45]。基于唾液的结合测定表明，S60-VP8颗粒结合H1和或Leb抗原阳性唾液样品，但不结合H1和Leb抗原阴性的那些。这些数据表明，S60颗粒展示的VP8抗原具有配体结合功能的正确折叠，验证了S60-VP8颗粒作为RV疫苗候选物。改善了对S60颗粒展示的VP8抗原的免疫原性。将S60-VP8颗粒免疫小鼠N＝6并使用游离VP8抗原作为对照测量VP8特异性免疫应答以进行比较。三次免疫后，用S60-VP8颗粒免疫后的VP8特异性IgG应答比游离VP8诱导的高出11.6倍P＝0.0004图10A。作为阴性对照，S60颗粒不会引发任何VP8特异性IgG反应。这些数据表明S60颗粒能够改善所展示的RVVP8抗原的免疫原性。S60-VP8颗粒引发的抗血清增强了抗VP8-配体结合的阻断作用。VP8与RV宿主配体或受体的结合是RV感染的关键步骤[43]。因此，已经开发了针对RVVP8蛋白与HBGAs结合的体外阻断测定作为替代RV中和测定[47]。申请人使用先前开发的P-VP8颗粒[47]和Leb阳性唾液样品作为RV配体进行了这种阻断测定[45]。申请人发现，用S60-VP8颗粒免疫后的小鼠抗血清表现出比用免疫VP8抗原免疫后抗血清的50％阻断效价BT50高22.8倍P＝0.0003图10B，进一步支持S60颗粒显著改善了展示的RVVP8抗原的免疫原性的观察。作为阴性对照，用没有VP8抗原的S60颗粒免疫后的小鼠血清未显示出这种阻断。S60-VP8颗粒引发的抗血清增强了对RV感染的中和作用。申请人还进行了常规的基于细胞培养的中和测定，以确定S60-VP8颗粒引发的抗血清对抗细胞培养适应P[8]RVWa菌株的感染的中和活性。与其BT50一致见上文，用S60-VP8颗粒免疫后的小鼠抗血清在三种不同的血清稀释度1：75、1：150和1：300下表现出明显高于用游离VP8抗原免疫后抗血清的中和活性分别为P＝0.0003、P＝0.0001和P＝0.0016图10C。用没有VP8的S60颗粒免疫后的小鼠抗血清没有显示出这种中和活性。这些数据进一步支持了这样一种观点，即S60颗粒是一种能够增强所显示的RVVP8抗原免疫原性的有效疫苗平台，并且S60-VP8颗粒是一种很有前途的抗RV感染的候选疫苗。S60颗粒作为多功能疫苗平台。除了RVVP8抗原之外，申请人已经能够通过相同的暴露的S结构域C-末端通过接头将几种其他表位和抗原融合到S60颗粒上，包括甲型流感病毒的M2e表位、疟疾寄生虫恶性疟原虫的环子孢子表面蛋白CSP的TSR抗原、和戊型肝炎病毒的P结构域表1。因此，人工开发的S60颗粒用作新型疫苗开发的多功能平台。表1.由S60颗粒显示的表位和抗原的列表。1M2e表位是形成甲型流感病毒的质子选择性离子通道的基质-2M2蛋白的胞外域。2TSRCSP抗原是环子孢子CSP的主要表面蛋白的C-末端抗原，其在疟疾寄生虫恶性疟原虫的宿主细胞侵入中起关键作用。3全RVVP8是人P[8]轮状病毒的刺突蛋白的全长VP8结构域。3鼠RVVP8是鼠轮状病毒的刺突蛋白的核心部分。4HEVP结构域是戊型肝炎病毒衣壳的突出结构域。讨论在这项研究中，申请人开发了一种新技术，通过简单的细菌表达系统高效生产统一的60价NoVS60颗粒。这是通过利用自然地构建NoV衣壳的内壳的NoVVP1S结构域的同型相互作用以及用于稳定S结构域蛋白和增强S结构域间相互作用的若干修饰来实现的。具体地，申请人引入了R69A突变以破坏天然壳上暴露的蛋白酶切割位点，其否则会导致S蛋白的易降解。此外，申请人将三重V57CQ58CS136'C或四重V57CQ58CS136'CM140'C半胱氨酸突变引入在两个相邻的S结构域之间的两对空间接近残基V57M140'和Q58S136'，图6，以建立S-结构域间二硫键以获得比它们在天然NoV壳中表现出的更强的S-结构域间相互作用。最终，生物工程S结构域很容易通过简单的大肠杆菌系统以高产率生产，从而以高效率自我形成S60颗粒。具有60个柔性暴露的S结构域C末端的自组装多价S60颗粒是抗原呈递的理想平台，用于改善对展示的抗原的免疫原性以用于疫苗开发。通过构建显示60RVVP8蛋白主要的RV中和抗原的嵌合S60颗粒，该想法在本研究中得到了很大程度的证实。S60-VP8颗粒可以很容易地以高稳定性生产。它们引起小鼠对显示的VP8抗原的IgG反应显著高于游离VP8蛋白诱导的IgG反应。接种S60-VP8颗粒后的小鼠抗血清对RVVP8与其聚糖配体的结合显示出显著更强的阻断，并且与用游离VP8抗原免疫后的血清相比，对培养细胞中RV感染和复制的中和活性显著更高。虽然使用申请人实验室中的小鼠RV攻击模型确定了S60-VP8颗粒疫苗的保护功效，但本报告中提供的数据强烈支持这样一种观点，即S60-VP8颗粒是一种很有前景的RV感染候选疫苗，因此S60颗粒是新型疫苗开发抗原展示的优秀平台。天然NoV衣壳由180VP1制成，这是NoV的单一主要结构蛋白。通过真核系统体外表达NoVVP1通常产生180和60价VLP的混合物，并且两种VLP形式可通过人工变性和复性处理进行交换[60]。虽然尚未对其进行彻底研究，但先前通过杆状病毒昆虫细胞系统表达截短的S结构域似乎是自组装180价S颗粒[11,24]。然而，先前从未产生通过表达系统统一的60价NoVVLP或S颗粒。因此，申请人通过简单的大肠杆菌系统生产统一的NoVS60颗粒的技术代表了生物工程的进步。统一的S60颗粒的自我形成可能是由于重度修饰的S结构域和原核大肠杆菌表达系统的独特折叠环境的组合影响。候选疫苗的同质复杂性和大小是质量控制的重要考虑因素，因为疫苗复杂性和大小的变化将导致疫苗免疫结果的变化。人工引入的分子间二硫键可用作稳定病毒蛋白质颗粒或复合物的一般方法。在申请人先前构建NoVP颗粒期间，申请人发现在NoVP结构域末端添加含半胱氨酸的肽通过P-二聚体间二硫键促进和稳定P颗粒形成[20-23]。在该当前研究中，S60颗粒有效地自组装图3D，但是由于添加了VP8抗原，原始形式的S60-VP8颗粒的形成效率相对较低图5C。值得注意的是，通过引入S结构域间二硫键，S60-VP8颗粒的自身形成效率显著提高。这是通过两个基本步骤实现的。首先，申请人分析了GII.4NoVWenJiang，未发表的数据的壳结构，以确定两个相邻S结构域之间的两对空间上接近5.7至的残基V57M140'和Q58S136'图6，A和B。然后将这些残基中的两到四个以不同的组合同时突变成半胱氨酸：1V57CM140’C，2Q58CS136’C，3V57CQ58CS136’C，4V57CQ58CS140’C，和5V57CQ58CS136’CS140’C，然后生产和测量所得S60-VP8颗粒的自身形成效率。在这些突变中，具有三重半胱氨酸突变的S60-VP8颗粒V57CQ58CS136'C表现出最高的颗粒形成效率，其中95％的S-VP8蛋白自组装成S60-VP8颗粒图6，F到J。突变的S-VP8蛋白的二聚体和单体形式完全消失比较图6H与图5C和图E。申请人还注意到具有四联半胱氨酸突变的S60-VP8颗粒V57CQ58CS136'CM140'C与具有三半胱氨酸突变的那些相比表现出S6O-VP8颗粒形成几乎相同的高效率数据未显示。然而，各种半胱氨酸突变组合中这些不同结果背后的详细结构基础或机制仍然是难以捉摸的。这些结果和申请人之前对P颗粒的研究[20-23]表明，分子间二硫键的引入可以用作促进和稳定病毒蛋白质颗粒或复合物形成的一般方法。根据这些数据，使用具有R69A和V57CQ58CS136'C突变的S60-VP8颗粒进行下游实验，而具有相同突变的修饰的S结构域用于和将用于产生稳定的S60颗粒，作为显示其他抗原的平台。本研究中的S60-和S60-VP8颗粒通过与S结构域的暴露的C-末端或S-VP8蛋白连接的小Hisx6肽纯化。申请人的数据显示GST标签不适合S60和S60-VP8颗粒生产，因为它很大220个残基，扰乱了S60颗粒的形成，因此需要通过额外的凝血酶切割步骤去除，使纯化过程复杂化。此外，我们还测试了无标记纯化方法的可能性。申请人发现，S60和S60-VP8颗粒都可以通过硫酸铵选择性沉淀并在PBS和其他缓冲液中分离数据未显示。最后，申请人发现S60和S60-VP8颗粒通过凝胶过滤尺寸排阻柱和阴离子交换色谱法数据未显示作为单峰洗脱。这些数据共同表明，S60和S60-VP8颗粒，以及最可能的其他S60-抗原嵌合颗粒可以通过无标记方法纯化。60个自由暴露的C端是促进S60颗粒成为有用的疫苗平台的另一个特征。外源抗原或表位可以通过重组DNA技术通过柔性接头简单地融合到S结构域的末端。这项研究清楚地表明，S60颗粒可以很好地呈现Hisx6肽和RVVP8抗原，正如S60-Hisx6和S60-VP8颗粒的结构稳定性以及它们对于TALONCellThru树脂Hisx6和H1和Leb配体RVVP8的优异结合能力所显示的那样。此外，S60颗粒可以很好地呈现几种其他测试抗原或表位的事实表明S60颗粒是多功能疫苗平台。S60颗粒的建模，使用60价FCVVLP的晶体结构的S60-Hisx6以及通过cryoEM技术重建S60-VP8颗粒的3-D结构，为S60颗粒如何显示Hsix6肽和RVVP8抗原的结构基础提供了新的见解。将S60颗粒模型的结构拟合到S60颗粒区域，以及将60拷贝VP8抗原复制到S60-VP8颗粒cryoEM密度图的突出区域，进一步阐明了S60颗粒与其展示的抗原之间的结构关系。这些结构数据将有助于设计和理解S60颗粒对其他外来抗原的未来呈现。最后，这些结构研究还证实了S60颗粒和S60-VP8颗粒的60价T＝1二十面体对称性。总之，我们开发了一种易于生产、高稳定性和高免疫原性的自组装多价蛋白纳米颗粒，用作抗原展示的理想平台。作为概念证明，已经构建了显示60拷贝RV中和VP8抗原的嵌合S60颗粒。申请人的数据表明，高免疫原性S60-VP8颗粒是一种有前途的抗RV感染的候选疫苗，并且S60颗粒是增强各种抗原的免疫原性的多功能平台，用于针对不同病原体的新型疫苗开发。参考文献[1]TanM,JiangX.NorovirusPparticle:asubviralnanoparticleforvaccinedevelopmentagainstnorovirus,rotavirusandinfluenzavirus.NanomedicineLond2012；7:889-97。[2]TanM,JiangX.Subviralparticleasvaccineandvaccineplatform.Currentopinioninvirology2014；6C:24-33。[3]TanM,JiangX.RecentAdvancementsinCombinationSubunitVaccineDevelopment.Humanvaccines&immunotherapeutics2016:0。[4]PatelMM,WiddowsonMA,GlassRI,AkazawaK,VinjeJ,ParasharUD.Systematicliteraturereviewofroleofnorovirusesinsporadicgastroenteritis.EmergInfectDis2008；14:1224-31。[5]GlassRI,NoelJ,MitchellD,HerrmannJE,BlacklowNR,PickeringLK等人.Thechangingepidemiologyofastrovirus-associatedgastroenteritis:areview.ArchivesofvirologySupplementum1996；12:287-300。[6]PrasadBV,HardyME,DoklandT,BellaJ,RossmannMG,EstesMK.X-raycrystallographicstructureoftheNorwalkviruscapsid.Science1999；286:287-90。[7]BuW,MamedovaA,TanM,XiaM,JiangX,HegdeRS.StructuralbasisforthereceptorbindingspecificityofNorwalkvirus.JVirol2008；82:5340-7。[8]CaoS,LouZ,TanM,ChenY,LiuY,ZhangZ等人.Structuralbasisfortherecognitionofbloodgrouptrisaccharidesbynorovirus.JVirol2007；81:5949-57。[9]ChenY,TanM,XiaM,HaoN,ZhangXC,HuangP等人.Crystallographyofalewis-bindingnorovirus,elucidationofstrain-specificitytothepolymorphichumanhisto-bloodgroupantigens.PLoSpathogens2011；7:e1002152。[10]ChoiJM,HutsonAM,EstesMK,PrasadBV.Atomicresolutionstructuralcharacterizationofrecognitionofhisto-bloodgroupantigensbyNorwalkvirus.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2008；105:9175-80。[11]TanM,HegdeRS,JiangX.ThePdomainofnoroviruscapsidproteinformsdimerandbindstohisto-bloodgroupantigenreceptors.JVirol2004；78:6233-42。[12]TanM,JiangX.Norovirusgastroenteritis,carbohydratereceptors,andanimalmodels.PLoSpathogens2010；6:e1000983。[13]TanM,JiangX.Norovirus-hostinteraction:Multi-selectionsbyhumanhisto-bloodgroupantigens.Trendsinmicrobiology2011；19:382-8。[14]TanM,JiangX.Histo-bloodgroupantigens:acommonnichefornorovirusandrotavirus.ExpertRevMolMed2014；16:e5。[15]HuangP,FarkasT,ZhongW,TanM,ThorntonS,MorrowAL等人.Norovirusandhisto-bloodgroupantigens:demonstrationofawidespectrumofstrainspecificitiesandclassificationoftwomajorbindinggroupsamongmultiplebindingpatterns.JVirol2005；79:6714-22。[16]LiuW,ChenY,JiangX,XiaM,YangY,TanM等人.AUniqueHumanNorovirusLineagewithaDistinctHBGABindingInterface.PLoSPathog2015；11:e1005025。[17]ShankerS,ChoiJM,SankaranB,AtmarRL,EstesMK,PrasadBV.Structuralanalysisofhisto-bloodgroupantigenbindingspecificityinanorovirusGII.4epidemicvariant:implicationsforepochalevolution.JVirol2011；85:8635-45。[18]ShankerS,CzakoR,SankaranB,AtmarRL,EstesMK,PrasadBV.Structuralanalysisofdeterminantsofhisto-bloodgroupantigenbindingspecificityingenogroupInoroviruses.JVirol2014；88:6168-80。[19]HansmanGS,BiertumpfelC,GeorgievI,McLellanJS,ChenL,ZhouT等人.CrystalStructuresofGII.10andGII.12NorovirusProtrudingDomainsinComplexwithHisto-BloodGroupAntigensRevealDetailsforaPotentialSiteofVulnerability.JVirol2011；85:6687-701。[20]TanM,FangPA,XiaM,ChachiyoT,JiangW,JiangX.TerminalmodificationsofnorovirusP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权利要求：1.一种用于抗原呈递的多价二十面体组合物，其包含S颗粒，其中所述S颗粒包含重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包含a诺罗病毒NoVS结构域蛋白；b可操作地连接到所述诺罗病毒S结构域蛋白的接头蛋白结构域；和c可操作地连接到所述接头的抗原蛋白结构域。2.根据权利要求1所述的多价二十面体组合物，其中所述组合物具有二十面体对称结构。3.根据权利要求1或2所述的多价二十面体组合物，其中所述组合物包含60个抗原呈递位点。4.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺罗病毒S结构域蛋白质包含所述NoVS结构域蛋白的蛋白酶切割位点中的突变，其中所述突变使得所述位点对胰蛋白酶切割具有抗性。5.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺罗病毒S结构域蛋白包含蛋白酶切割位点的突变，其中所述突变位于第69位或第70位，并且其中所述突变使所述位点对胰蛋白酶切割具有抗性。6.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺如病毒S结构域蛋白包含蛋白酶切割位点的突变，其中所述突变发生在位置R69，优选地其中所述突变是足以破坏蛋白酶切割位点的K以外的任何氨基酸，更优选地其中所述突变是R69A。7.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺如病毒S结构域蛋白包含蛋白酶切割位点的突变，其中所述突变发生在位置N70，优选地其中所述突变是足以破坏蛋白酶切割位点的P以外的任何氨基酸。8.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺罗病毒S结构域蛋白包含足以提供非天然二硫键结合位点的突变。9.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺罗病毒S结构域蛋白包含在空间上彼此接近的至少两个氨基酸至半胱氨酸残基的突变，其足以在多价二十面体S颗粒的相邻S结构域蛋白之间提供至少一个非天然二硫键结合位点，或者至少两个非天然二硫键结合位点，或至少三个非天然二硫键结合位点。10.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺罗病毒S结构域蛋白包含足以提供至少一个非天然二硫键形成位点的突变，其中所述突变选自V57C、Q58C、S136C、M140C或其组合。11.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述诺罗病毒S结构域蛋白是杯状病毒的蛋白质，其中所述杯状病毒的特征在于具有180个拷贝的单一衣壳蛋白。12.根据权利要求1所述的多价二十面体组合物，其中所述接头包含长度足以在S结构域蛋白颗粒和展示的抗原之间提供空间和一定柔性的氨基酸序列。13.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述接头包含三至六个氨基酸。14.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述抗原蛋白结构域包含大小为8个氨基酸至约300个氨基酸、或8个氨基酸至约400个氨基酸、或8个氨基酸至约500个氨基酸的抗原。15.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述抗原蛋白结构域包含轮状病毒RV抗原。16.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述抗原蛋白结构域包含RV刺突蛋白抗原VP8抗原。17.根据任一前述权利要求所述的多价二十面体组合物，其中所述抗原蛋白结构域包含选自以下的抗原：疟疾寄生虫恶性疟原虫的环子孢子蛋白CSP的TSR抗原、甲型流感病毒的HA1蛋白和M2e表位的受体结合结构域、戊型肝炎的P结构域抗原、星状病毒的表面刺突蛋白及其组合。18.一种重组融合蛋白，其包含a诺罗病毒NoVS结构域蛋白，优选地其具有一个或多个突变以破坏蛋白酶位点，更优选地其具有一个或多个突变以破坏蛋白酶位点并引入一个或两个或三个半胱氨酸残基；b可操作地连接到所述诺罗病毒S结构域蛋白的接头蛋白结构域；和c可操作地连接到所述接头的抗原蛋白结构域。19.一种制备权利要求1-17中任一项所述的多价二十面体结构的方法，包括步骤：a制备包含修饰的NoVS结构域蛋白的第一区域，其中所述修饰包含足以破坏暴露的蛋白酶切割位点的突变，其中所述突变防止蛋白质降解，优选地R69A突变，和在所述诺罗病毒NoVS结构域蛋白中引入一个或多个突变，其足以产生S-结构域蛋白间二硫键，优选地选自V57C、Q58C、S136C和M140C及其组合的突变，和b以接头和抗原重组地表达所述第一个区域。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述组合物在大肠杆菌中产生。21.一种在有需要的个体中引发免疫应答的方法，包括施用根据权利要求1-17中任一项所述的组合物的步骤，优选地多于一次、或多于两次、或多于三次施用所述组合物。22.一种容器，其包含至少一剂根据权利要求1-17中任一项所述的组合物。23.一种试剂盒，其包含一个或多个根据权利要求22所述的容器、递送装置和用于施用所述组合物的说明书。

百度查询： 儿童医院医学中心 诺如病毒S颗粒类疫苗及其制备和使用方法

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