申请/专利权人：中国检验检疫科学研究院

申请日：2019-11-06

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN112763640B

主分类号：G01N30/88

分类号：G01N30/88;G06F18/2135;C12N1/20;C12R1/01

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.09#授权;2021.05.25#实质审查的生效;2021.05.07#公开

摘要：本发明涉及共计23个用于鉴别12a、12b、12c和4b四种血清型单增李斯特菌Listeriamonocytogenes，Lm的差异代谢物。本发明还涉及针对四组血清型别的Lm两两之间的多元统计分析方法，包括偏最小二乘‑判别分析PartialLeastSquares‑DiscriminantAnalysis,PLS‑DA和正交偏最小二乘‑判别分析OrthogonalPartialLeastSquares‑DiscriminantAnal‑ysis,OPLS‑DA,结合基于OPLS‑DA的各代谢物变量权重值VariableImpor‑tantinProjection,VIP对Lm进行分类判别，所述方法包括菌株培养、菌株淬灭、代谢产物提取及浓缩、代谢产物衍生化、GC‑MS检测。使用本发明对四种血清型单增李斯特菌代谢组学鉴定方法，过程操作简单、便捷，鉴别效率高，灵敏度高，重现性好，可实现对4种血清学单增李斯特菌的高效、准确的鉴别。

主权项：1.一种基于代谢组学筛选4种单增李斯特菌血清型差异代谢物的方法，其特征在于：包括以下步骤：1菌株培养：取冻存Lm菌种遵循无菌操作流程，在生物安全柜中用无菌枪头扎取菌种保藏磁珠接种，37℃下培养16-18h，获得菌株稳定培养物，即菌株复苏；取复苏菌液接种至BHI液体培养基中，37℃下培养16-18h，即菌株的二次活化传代培养，保证菌株处于最佳的生长状态；2菌株淬灭：取二次活化菌液迅速加入到淬灭试剂中，快速涡旋混匀，-20℃条件下8000×g离心5min，弃去上清液，残余上清液用吸水纸去除，菌体沉淀用于提取胞内代谢产物；3代谢产物提取及浓缩：向菌体沉淀加入50％冷甲醇重悬，再加入氯仿，涡旋混匀，置于-40℃提取，每15min涡旋30s，提取结束后离心收集上清液至玻璃小瓶中，并向剩余样品中继续添加1mL的50％冷甲醇，涡旋混匀，离心后合并上清，向上清液中添加4倍体积的超纯水，并置于-80℃预冻，使用真空冷冻干燥机在-60℃条件下进行冷冻干燥，冻干样品-80℃保存直到分析；4代谢产物衍生化：向玻璃衍生小瓶中加入甲氧胺盐酸吡啶溶液，强烈震荡，于37℃肟化反应；取出后加入含1％TMCS的BSTFA衍生试剂，于70℃反应；取出样本，室温放置30min，离心取上清，进行GC-MS的代谢组学分析；5GC-MS检测：毛细管色谱柱为HP-5ms；仪器参数设定为：进样口温度280℃，EI离子源温度230℃，四极杆温度150℃，纯度大于99.999％的高纯氦气作为载气，不分流进样；升温程序为：初始温度80℃，维持2min，10℃min的速度升至290℃，并维持9min；采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为50-550mz；6MS-DIAL的定性分析：MS-DIAL是基于DIA模式小分子质量反卷积和定量分析，通过分析两个连续的数据轴，有效地发现前体离子峰，MS2Dec算法用于提取色谱中的“模型峰”，去除背景噪声，通过保留时间，精确分子质量，与公共数据库匹配相似度实现化合物的定性；同时也实现了非目标代谢组学所需的额外功能，所述额外功能为峰对齐、滤波和缺失值插值，代谢物定性基于Fiehn数据库；7多元统计分析：先采用无监督的主成分分析来观察各样本之间的总体分布和整个分析过程的稳定性，然后用有监督的偏最小二乘法分析及正交偏最小二乘法分析来区分各组间代谢轮廓的总体差异；8筛选差异代谢物：采用多维分析和单维分析相结合的办法，来筛选组间差异代谢物，所述差异代谢物如表1至表3所示；表14b血清型Lm同12a、12b、12c血清型Lm相比差异代谢物 表212b血清型Lm同12a、12c、4b血清型Lm相比差异代谢物 表312c血清型Lm同12a、12b、4b血清型Lm相比差异代谢物 。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国检验检疫科学研究院 单增李斯特菌四种血清型差异代谢物鉴别新方法

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