申请/专利权人：皖南医学院第一附属医院(皖南医学院弋矶山医院)

申请日：2023-05-29

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN116837031B

主分类号：C12N15/867

分类号：C12N15/867;C12N15/86;C12N15/49;C12N15/47;C12N7/01;C12N5/10;C12R1/93

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.09#授权;2023.10.24#实质审查的生效;2023.10.03#公开

摘要：本发明提供了一种利用基于Csy4改造的低背景Tet‑ON‑3G系统打造一种慢病毒稳转包装细胞系及慢病毒制备方法，用于包括免疫细胞治疗中的应用。本发明中用于生产慢病毒的方法，不再使用质粒，简化了慢病毒生产流程，极大地降低了生产成本。诱导系统对诱导剂的反应灵敏，低背景表达的同时，最大水平的诱导目的基因的表达。该慢病毒包装细胞系生产慢病毒能极大的提高载体的均一性及表达量，批间差异小，工艺易放大，病毒滴度高，杂质含量少，病毒泄露低。克服了目前慢病毒载体生产泄漏率高、工艺难放大、杂质难纯化的局限，在包括免疫治疗领域中广泛应用。

主权项：1.一种基于转录后调控的慢病毒稳定生产细胞系的制备方法，其特征在于，（1）分别以GagPol质粒、VSVG质粒为主质粒，包装慢病毒；（2）将VSVG质粒包装的慢病毒转导宿主细胞；（3）加入第一抗生素嘌呤霉素，其用量为0.25～3ugmL，用有限稀释法进行阳性筛选，得到第一阳性的单克隆细胞；（4）鉴定第一阳性单克隆细胞；（5）再将GagPol质粒包装的慢病毒转导步骤（4）筛选鉴定出的第一阳性单克隆细胞；（6）加入第二抗生素为嘌呤霉素和杀稻瘟菌素的混合物，其用量分别为0.25～3ugmL和10～100ugmL，有限稀释法进行第二次筛选，得到第二阳性单克隆细胞，经半定量PCR鉴定后，即确定为慢病毒稳定包装细胞系；其中，所述GagPol质粒除包括Gag、Pol和Rev基因外，还包含有TRE3G启动子、序列特异性的核糖核酸内切酶Csy4识别位点、嘌呤霉素抗性基因、TRE3G启动子驱动的Csy4反向表达盒、hPGK启动子驱动的Csy4表达盒；所述VSVG质粒除了包含VSVG基因，还包括TRE3G启动子、序列特异性的核糖核酸内切酶Csy4识别位点、hPGK启动子、杀稻瘟菌素抗性基因、TRE3G启动子驱动的Csy4反向表达盒、hPGK启动子驱动的Csy4表达盒；所述GagPol基因如SEQIDNO:1所示，Rev基因如SEQIDNO:2所示，VSVG基因如SEQIDNO:3所示，嘌呤霉素抗性基因如SEQIDNO:9所示，杀稻瘟菌素抗性基因如SEQIDNO:10所示；所述GagPol质粒如SEQIDNO:11所示，VSVG质粒如SEQIDNO:12所示。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 皖南医学院第一附属医院(皖南医学院弋矶山医院) 一种生产慢病毒的低背景稳定生产细胞株的构建及其应用

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