申请/专利权人：通用生物(安徽)股份有限公司

申请日：2023-12-01

公开（公告）日：2024-04-05

公开（公告）号：CN117821515A

主分类号：C12N15/867

分类号：C12N15/867;C12N15/62;C12N5/10;C12Q1/70;C12Q1/02;C12R1/93

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.23#实质审查的生效;2024.04.05#公开

摘要：本发明公开了表达ACE2蛋白的HEK293T细胞系构建方法及应用，属于分子生物学中的基因工程和细胞工程技术领域，包括以下步骤：第一步、ACE2基因序列合成及慢病毒载体构建；第二步、慢病毒包装；第三步、慢病毒感染及药筛；第四步、单克隆分选；第五步、ACE2293T单克隆细胞系qPCR及WB检测；第六步、假病毒感染验证；本发明通过基因序列合成及慢病毒载体构建，慢病毒包装，慢病毒感染及药筛，单克隆分选及qPCR及WB检测等步骤制得表达ACE2蛋白的HEK293T细胞系，此构建好的细胞株可以应用于新冠病毒感染中ACE2基因的功能的研究，对于研究新冠病毒的感染机制具有十分重要的意义。

主权项：1.表达ACE2蛋白的HEK293T细胞系构建方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步、从NCBI数据库网站查ACE2基因的蛋白编码区域基因序列，记作SEQIDNO1；在SEQIDNO1后面引入6xHis标签，并在前后分别引入同源重组臂，最终合成的序列记作SEQIDNO2；将SEQIDNO2序列使用单段重组试剂盒，以无缝克隆的方式构建到使用EcoRI和BamHI线性化并胶回收后的pLVX-Puro慢病毒载体里，得到慢病毒载体pLVX-ACE2-6xHis-Puro，最终进行质粒小抽并测序验证正确的单克隆进行扩大培养之后，进行质粒大抽，得到用于慢病毒包装的pLVX-ACE2-6xHis-Puro；第二步、利用pLVX-ACE2-6xHis-Puro进行慢病毒包装，得到成功感染了pLVX-ACE2-6xHis-Puro慢病毒的293T细胞；第三步、将成功感染了pLVX-ACE2-6xHis-Puro慢病毒的293T细胞，使用0.25％胰蛋白酶消化之后进行计数，根据细胞浓度，吸取100个细胞并加入20mL含有10％胎牛血清的DMEM培养基中并充分混匀；将上述混合的细胞以每孔200uL的体积接种到1个96孔的细胞培养板中，置于培养箱中培养，直至单克隆细胞生长成大团，在显微镜下观察96孔板的细胞集落，选取单个细胞长成并且细胞状态和形态良好的单克隆细胞进行扩大培养，得到5个单克隆细胞系；第四步、将上述的5个单克隆细胞系分别编号ACE2293Tclone1-5，然后野生型细胞标记为293T-WT，对前面6个细胞分别使用trizol方法进行RNA提取，然后反转录成CDNA之后使用ACE2引物进行qPCR检测，得到表达量最高的单克隆细胞系；第五步、ACE2293T单克隆细胞系qPCR及WB检测。第六步、假病毒感染验证。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 通用生物(安徽)股份有限公司 表达ACE2蛋白的HEK293T细胞系构建方法及应用

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