申请/专利权人：中国林业科学研究院林业研究所

申请日：2022-12-22

公开（公告）日：2024-04-05

公开（公告）号：CN116183470B

主分类号：G01N15/1433

分类号：G01N15/1433;G01N15/01;G01N1/28;G01N1/30;G01N1/40

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.05#授权;2023.06.16#实质审查的生效;2023.05.30#公开

摘要：本发明公开了一种基于细胞流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，属于细胞检测技术领域，包括如下步骤：木质部细胞原生质体制备及AnnexinV、PI染色处理；对染色的木质部细胞原生质体进行成像流式检测处理；对染色的木质部细胞原生质体进行流式分群、分选；对分选后不同凋亡亚群细胞显微成像检测其形态；提取分选后不同凋亡亚群细胞的RNA，利用RT‑qPCR检测细胞程序性死亡及材性形成相关基因的表达量。本发明检测木本植物细胞程序性死亡的方法，通过流式细胞仪分群分析出不同凋亡阶段细胞个数，得出不同阶段凋亡率；又进一步通过流式细胞仪对不同凋亡亚群细胞进行分选，通过RT‑qPCR鉴定相关基因表达水平；该方法利用流式细胞仪分选木质部细胞程序性死亡不同阶段的特定细胞，具有定量可靠，分析准确，结果精度高等优点。

主权项：1.一种基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，包括如下步骤：（1）将待检测木本植物茎段剥皮后，进行木质部细胞原生质体酶解，得到原生质体酶解细胞；（2）将步骤（1）中得到的原生质体酶解细胞进行离心悬浮处理，获得原生质体浓缩液；（3）向步骤（2）中得到的原生质体浓缩液中添加AnnexinV-FITC，孵育处理后，继续加入PI染色处理，获得木质部原生质体染色液；（4）对步骤（3）中得到的木质部原生质体染色液进行流式拍照检测，生成AnnexinV-FITCPI散点图，并获得阴性细胞、凋亡早期细胞和凋亡晚期细胞的染色细胞形态成像图；（5）对步骤（3）中得到的木质部原生质体染色液中的细胞进行分选，并分别收集不同时期细胞程序性死亡的亚群细胞；（6）显微拍照，分别观察步骤（5）分选后不同细胞程序性死亡时期的亚群细胞形态及分选前步骤（2）中的细胞形态；（7）RT-qPCR分析步骤（5）中分选后的不同亚群细胞，获得细胞凋亡和材性发育相关基因的表达量；结合基因表达定量分析，并依据细胞形态、大小和凋亡状态推测阴性细胞亚群细胞最小、少有破损、无荧光信号并且活性好，推测其包含未成熟纤维细胞、射线细胞和少量的形成层细胞；凋亡早期细胞亚群的细胞体积相对较大、细胞膜有破损并且有AnnexinV-FITC绿色荧光信号，推测其多为纤维细胞；凋亡晚期亚群细胞体积最大，破损严重，既有AnnexinV-FITC绿色荧光信号又有PI红色荧光信号，推测其多为导管细胞；步骤（1）中，酶解的具体步骤如下：1）温室培养2月龄银腺杨84K，分离表皮和树干；2）加入30ml酶解液：0.6M的D-mannitol；20mM并且pH5.7的MES；1.5%的纤维素酶R-10；0.4%的果胶酶Y-23；20mM的KCL；10mM的CaCl2；0.1%的BSA，到50ml离心管中，将剥皮后的树干放进离心管中，25℃避光放置，酶解40min；3）将酶解后的树干取出来，放在30ml的W5溶液：2mM并且pH5.7的MES、3M的NaCl、1M的CaCl2和2M的KCl；轻轻晃动树干，让酶解后的细胞落到W5溶液中；4）将W5溶液用70µm细胞筛过滤，200g离心5min；5）去掉上清液，W5溶液重悬细胞，200g离心5min；6）W5溶液重悬细胞，调整细胞浓度约106cellsml，得到木质部原生质体细胞浓缩液；步骤（3）中用AnnexinV-FITC和PI进行处理的具体步骤如下：1）上述木质部原生质体细胞浓缩液中，按100µl细胞液加入5µl的比例，加入AnnexinV-FITC，冰上避光孵育20min；2）200g离心5min，加入相同体积WI溶液：0.6MD-mannitol、20mMMES、20mMKCL和0.1%BSA；得浓缩液；3）向上述2）所得浓缩液中，继续加入PI染色，按100µl细胞液加入1µl的比例加入PI，冰上避光孵育5min；步骤（5）中分选的具体步骤如下：1）上CSTbeads，完成流式细胞分选仪的质控操作，保证不同时间实验数据的一致性，调试好细胞分选的各项参数，100µm喷嘴，4way分选，4waypurity模式，调节偏转电压，使液流直接进入到收集中央；2）新建实验模板Experiment，参数包括FSC,SSC,FITC和PI；先上样阴性对照样本，然后，上样待测样本，各保存10000个细胞，根据阴性对照和阳性待测样本，划出荧光信号门；将对应荧光信号的门分别选入对应分选Way，上样后开始分选，根据需要选择分选结束方式；步骤（1）中所述木本植物为杨树。

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权利要求：

百度查询： 中国林业科学研究院林业研究所 一种基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法

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