申请/专利权人：江苏苏博生物医学科技南京有限公司;江苏苏博生物医学股份有限公司

申请日：2018-12-17

公开（公告）日：2024-04-05

公开（公告）号：CN109387640B

主分类号：G01N33/68

分类号：G01N33/68;G01N33/577;G01N33/558;G01N21/64

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.05#授权;2019.03.22#实质审查的生效;2019.02.26#公开

摘要：本发明公开了一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法，可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条包括：样品结合垫、检测垫、吸样垫和底板，样品结合垫、检测垫和吸样垫依次设置在底板上，且样品结合垫和吸样垫分别叠压在检测垫的两端上，检测垫上设有四条检测线和一条质控线。本发明所需样本量少，灵敏度高，检测背景信号低，特异性强，线性范围宽，操作简便，结果可靠；进一步，通过同时检测脑脊液中PCT、CRP、ESAT～6～CFP10抗原及隐球菌荚膜多糖抗原的含量，能够对脑膜炎的类型有一个大致的判断，可有效减小临床诊断时因经验主义出现误诊的可能性，为脑膜炎类型的确诊提供了较为准确的免疫学依据。

主权项：1.一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括底板，该底板上依次设置有样品结合垫、检测垫和吸样垫，样品结合垫和吸样垫分别叠压在检测垫的两端上；该样品结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体、抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体；该检测垫上设有相互平行的检测线T1、T2、T3、T4和质控线C线，T1、T2、T3、T4和质控线C线沿着检测垫的长度方向依次设置、且相互平行，质控线C线离吸样垫的距离最近，检测线T1、T2、T3、T4包被有所测指标另一表位的抗体，质控线C包被有羊抗鼠IgG；检测垫为硝酸纤维素膜、且为孔径5～12μm的多孔膜；样品结合垫的材质为玻璃纤维素膜；吸样垫的材质为吸水滤纸；时间分辨荧光微球为修饰过的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球表面修饰官能团为羧基，聚苯乙烯微球的粒径为200nm；时间分辨荧光微球内部填充1wt%铕的螯合物；时间分辨荧光微球标记的方法为：将1mg时间分辨荧光微球用200μLpH=6的100mM的MES缓冲液清洗2次后重悬，加入1～3～二甲氨基丙基～3～乙基碳二亚胺盐酸盐及N～羟基琥珀酰亚胺，使其浓度分别为0.08%及0.15%，30℃振荡活化60min，加入10%乙醇20μl，混匀后离心洗涤除去活化剂，再次加入200μLpH=7.5的60mM的硼酸缓冲液重悬微球，混匀后再分别加入80μg抗PCT单克隆抗体、80μg抗CRP单克隆抗体、80μg抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体及80μg抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，37℃振荡标记2h，离心后用复溶缓冲液重悬，加入10%BSA50μl封闭30min，得到时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体复合物、抗CRP单克隆抗体复合物、抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体复合物及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体复合物；复溶缓冲液为0.03MTris～Hcl，pH7.5～8.5，包含0.08%BSA、0.08%T～20、4%海藻糖和0.05%NaN3，前述百分比为质量百分比；上述试纸条通过以下制备方法制备：（1硝酸纤维素膜处理：将NC膜贴至底板的指定位置，取含1%蔗糖的50mM的pH7.4磷酸盐缓冲液将另一表位的PCT单克隆抗体、CRP单克隆抗体、ESAT～6～CFP10多克隆抗体、隐球菌荚膜多糖单克隆抗体分别稀释至1mgml，用于制备4条T线；用含1%蔗糖的50mM的磷酸缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1mgml，用于制备C线；按1μlcm划液量，通过biodot划膜仪将上述5种稀释后的抗体均匀得划至NC膜上制备T线和C线；将划好的NC膜放置于37℃干燥箱中，干燥3h；（2样品结合垫的处理：玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液浸泡进行预封闭后，37℃干燥3h；通过Biodot仪器的airjet喷头，将标记有时间分辨荧光微球的抗体按照5μlcm的量超声喷雾至玻璃纤维素膜上，37℃干燥3h，制备得到样品结合垫；含有表面活性剂的缓冲液配方：100mMPB，pH7.4，其中含有2％NaCl，2％BSA、0.5％酪蛋白、0.1％T～20、和5％蔗糖，前述百分比为质量百分比；（3）组装：将步骤（2）得到的样品结合垫固定叠压在步骤（1）得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸样垫固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，两端的叠压长度均为2mm，用裁膜仪按每条4mm的宽度进行裁剪，即得成品；针对PCT的线性回归方程为Y＝0.8624X+3.0824，R2=0.9995；针对CRP的线性回归方程为Y＝0.8851X+3.9226，R2=0.9994；针对ESAT～6～CFP10抗原的线性回归方程为Y＝1.2223X+2.6403，R2=0.9999；针对隐球菌荚膜多糖抗原的线性回归方程为Y＝0.9689X+3.523，R2=0.9997。

全文数据：一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法技术领域本发明涉及一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法，属于生物技术领域。背景技术中枢神经系统感染是儿科常见病和多发病，以细菌性脑膜炎和病毒性脑膜炎最为多见。近年来，随着结核杆菌的基因突变、抗结核药物研制相对滞后和AIDS病患者的增多，国内外结核病的发病率及病死率逐渐增高。同时，随着抗生素、免疫抑制剂和皮质激素的广泛应用，机体菌群失调或免疫功能下降，使得隐球菌性脑膜炎的发病率也明显升高。由于这几种脑膜炎表现出来的病症有着相似性，尤其是结核性脑膜炎和隐球菌性脑膜炎在临床上表现酷似，容易误诊，病患得不到及时的有效治疗从而丧命。因此急需寻找一种能早期诊断及鉴别脑膜炎病因的方法，对治疗、预后、转归、减少患者出现后遗症将有极大的临床意义。众多研究表明，在细菌性和病毒性脑膜炎患者中，脑脊液中PCT和CRP的水平均显著高于健康儿童，这说明脑脊液中PCT和CRP可以作为儿童病毒性和细菌性脑膜炎临床诊断的指标。由于感染结核分枝杆菌MTU体内首先出现结核抗原，而结核抗体则要感染后8周起逐渐产生，因此检测脑脊液中的MTU分泌特异性抗原可作为快速诊断脑膜活动性结核的有效途径。在感染早期，致病型结核分枝杆菌一般会分泌大量的特异性蛋白，即6000～早期分泌性抗原靶ESAT～6与抗原培养滤液蛋白10CFP10，并且这两种蛋白不存在卡介苗BCG中，故其可以作为活动性结核的标志物。对于隐球菌性脑膜炎，国内多采用脑脊液图片、阿利新蓝染色、墨汁染色和真菌培养等方法，虽然真菌培养是确诊隐脑的金标准，但耗时较长，需2～5d，有的真菌需要10d，培养阳性率低；涂片和墨汁染色阳性率较高，尤其是对脑脊液离心后镜检，可提高阳性率，但仍然存在漏检和误诊的情况，造成患者不能及时治疗。发明内容本发明提供一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法，本发明试纸条通过免疫层析法，配合使用荧光免疫分析仪，可以方便、准确且高灵敏度地同时检测出脑脊液中PCT、CRP、ESAT～6～CFP10抗原、隐球菌荚膜多糖抗原的含量，为脑膜炎类型的初判提供一定的理论依据。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，包括：样品结合垫、检测垫、吸样垫和底板，样品结合垫、检测垫和吸样垫依次设置在底板上，且样品结合垫和吸样垫分别叠压在检测垫的两端上，检测垫上设有四条检测线和一条质控线。上述试纸条的检测指标包括脑脊液中PCT、CRP、ESAT～6～CFP10抗原和隐球菌荚膜多糖抗原；样品结合垫内包被有时间分辨荧光微球标记的抗体，时间分辨荧光微球标记的抗体为检测指标的抗体。为了提高检测的准确性，样品结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体和抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体。为了方便制造，并保证检测的准确性，时间分辨荧光微球为修饰过的聚苯乙烯微球；聚苯乙烯微球表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，聚苯乙烯微球的粒径为100～500nm，优选为180～300nm。为了提高检测的灵敏度，时间分辨荧光微球内部填充有1％ww镧系元素的螯合物，镧系元素为铕、钐、鈊或镝中的一种。申请人经研究发现，采用免疫法测定脑脊液中隐球菌荚膜多糖抗原的含量对隐脑的诊断及疗效观察有重要临床应用价值，灵敏度高，操作简单，适合推广；时间分辨荧光免疫测定TRFIA是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度，同时具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作简便、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰等优点。上述时间分辨荧光微球标记的方法为：包括顺序相接的如下步骤：1将时间分辨荧光微球溶于缓冲液中，加入活化剂恒温震荡活化；2将步骤1所得的物料中加入有机溶剂，混匀后，离心、洗涤除去活化剂，用缓冲液重悬微球，随后分别加入抗PCT单克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，恒温震荡标记，离心后用复溶缓冲液重悬，加入封闭剂进行封闭，得到时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体复合物、抗CRP单克隆抗体复合物、抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体复合物及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体复合物，用于PCT、CRP、ESAT～6～CFP10抗原以及隐球菌荚膜多糖抗原性能的评估。优选，步骤1和步骤2中的活化剂为1～3～二甲氨基丙基～3～乙基碳二亚胺盐酸盐或和N～羟基琥珀酰亚胺。优选，时间分辨荧光微球标记的方法为：包括顺序相接的如下步骤：1将时间分辨荧光微球用pH6100mM的MES缓冲液清洗2次后重悬，加入活化剂EDC1～3～二甲氨基丙基～3～乙基碳二亚胺盐酸盐和NHSN～羟基琥珀酰亚胺，使它们的浓度分别为0.05％～0.1％和0.1％～02％，30±5℃振荡活化60±5min；2将步骤1所得的物料中加入体积浓度为10％的乙醇，混匀后，离心、洗涤除去EDC或NHS，加入缓冲液重悬微球，混匀后再分别加入抗PCT单克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，37℃振荡标记2h，离心后用复溶缓冲液重悬，加入10％BSA封闭30min，得到时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体复合物、抗CRP单克隆抗体复合物、抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体复合物及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体复合物。上述复溶缓冲液包括Tris～Hcl、BSA、T～20、海藻糖和NaN3；优选地，复溶缓冲液为10～50mM的Tris～HclpH7.5～8.5，含有0.05～0.1％BSA、0.05～0.1％T～20、3～5％海藻糖和0.05％NaN3，前述百分比为质量百分比。为了避免相互影响，四条检测线相互平行，四条检测线分别为能够与时间分辨荧光微球标记的抗体特异性结合的配对抗体所形成的涂层，即采用双抗体夹心法检测各目标物的含量。优选，四条检测线和一条质控线相互平行，且沿着检测垫的长度方向依次设置，从样品结合垫到吸样垫的方向上，依次是四条检测线和一条质控线。也即四条检测线在检测垫上的前后顺序可以任意排列，质控线距离吸样垫的端部最近。为了提高检测的灵敏度和准确性，优选，质控线包被有羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgY或羊抗兔IgG。作为本申请的另一种优选方案，检测垫包括2～4条检测分垫，四条检测线随机地分布在检测分垫上，每条检测分垫上均设有一条质控线，同一检测分垫上，相比于检测线质控线离吸样垫的端部最近。为了降低成本，同时保证检测的灵敏度和准确性，检测垫为硝酸纤维素膜、且为孔径5～12um的多孔膜；样品结合垫的材质为玻璃纤维素膜或无纺布；吸样垫的材质为吸水滤纸。上述可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括顺序相接的如下步骤：1检测垫的处理：将检测垫贴在底板上，取含有1～5wt％蔗糖的10～50mM的pH7.4磷酸盐缓冲液将另一个表位的PCT单克隆抗体、CRP单克隆抗体、ESAT～6～CFP10多克隆抗体和隐球菌荚膜多糖单克隆抗体分别稀释至1±0.02mgml，用于制备四条检测线；用含有1～5wt％蔗糖的10～50mM的磷酸缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1±0.02mgml，用于制备质控线；按1±0.02μlcm划液量，通过biodot划膜仪将上述5种稀释后的抗体均匀得划至检测垫上制备检测线和质控线；将划好的检测垫放置于37±3℃干燥箱中，干燥3±0.2h；2样品结合垫的处理：样品结合垫用含有表面活性剂的缓冲液浸泡进行预封闭后，37±3℃干燥3h±0.2h；通过Biodot仪器的airjet喷头，将标记有时间分辨荧光微球的抗体按照5±0.02μlcm的量超声喷雾至样品结合垫上，37±3℃干燥3h±0.2h，制备得到样品结合垫；3组装：将步骤2得到的样品结合垫固定叠压在步骤1得到的检测垫的一端，并将吸样垫固定叠压在检测垫的另一端，叠压长度均为1～4mm，用裁膜仪按每条4～6mm的宽度进行裁剪，即得可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条。优选，步骤2中的缓冲液为100mMPBpH7.4，其中，含有2％NaCl、2％BSA、0.5％酪蛋白、0.1％T～20、和5％蔗糖，前述百分比为质量百分比。本发明未提及的技术均参照现有技术。本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明所需样本量少，灵敏度高，检测背景信号低，特异性强，线性范围宽，操作简便，结果可靠；进一步，通过同时检测脑脊液中PCT、CRP、ESAT～6～CFP10抗原及隐球菌荚膜多糖抗原的含量，能够对脑膜炎的类型有一个大致的判断，可有效减小临床诊断时因经验主义出现误诊的可能性，为脑膜炎类型的确诊提供了较为准确的免疫学依据；制备方法简单、已推广。附图说明图1为本发明一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条的结构示意图。其中：1为样品结合垫；2为检测垫；3为吸样垫；4为底板；T1、T2、T3和T4分别为四条检测线；C为质控线。图2为本发明中的PCT浓度对数值～荧光计数对数值标准曲线。图3为本发明中的CRP浓度对数值～荧光计数对数值标准曲线。图4为本发明中的ESAT～6～CFP10抗原浓度对数值～荧光计数对数值标准曲线。图5为本发明中的隐球菌荚膜多糖抗原浓度对数值～荧光计数对数值标准曲线。具体实施方式为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例1如图1所示，一种可对脑膜炎类型进行初判的时间分辨荧光免疫层析试纸条，包括底板4，该底板4上依次设置有上样品结合垫1、检测垫2和吸样垫3，样品结合垫1和吸样垫3分别叠压在检测垫3的两端上；该样品结合垫1上包被有时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体、抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体；该检测垫2上设有相互平行的检测线T1、T2、T3、T4和质控线C线，T1、T2、T3、T4和质控线C线沿着检测垫的长度方向依次设置、且相互平行，质控线C线离吸样垫3的距离最近，检测线T1、T2、T3、T4包被有所测指标另一个表位的单克隆抗体，质控线C包被有羊抗鼠IgG。检测垫为硝酸纤维素膜、且为孔径5～12um的多孔膜；样品结合垫的材质为玻璃纤维素膜；吸样垫的材质为吸水滤纸。时间分辨荧光微球为修饰过的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球表面修饰官能团为羧基，聚苯乙烯微球的粒径为200nm；时间分辨荧光微球内部填充1％ww铕的螯合物；时间分辨荧光微球标记的方法为：将1mg时间分辨荧光微球用200μLpH＝6的100mM的MES缓冲液清洗2次后重悬，加入1～3～二甲氨基丙基～3～乙基碳二亚胺盐酸盐及N～羟基琥珀酰亚胺活化剂，使其浓度分别为0.08％及0.15％，30℃振荡活化60min，加入10％乙醇20ul，混匀后离心洗涤除去活化剂，再次加入200μLpH＝7.5的60mM的硼酸缓冲液重悬微球，混匀后再分别加入80ug抗PCT单克隆抗体、80ug抗CRP单克隆抗体、80ug抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体及80ug抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，37℃振荡标记2h，离心后用复溶缓冲液重悬，加入10％BSA50ul封闭30min百分比为质量百分比，得到时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体复合物、抗CRP单克隆抗体复合物、抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体复合物及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体复合物。复溶缓冲液为0.03MTris～HclpH7.5～8.5，包含0.08％BSA、0.08％T～20、4％海藻糖和0.05％NaN3，前述百分比为质量百分比。上述试纸条可以通过以下制备方法制备：1硝酸纤维素膜NC膜处理：将NC膜贴至底板的指定位置，取含1％蔗糖的50mM的pH7.4磷酸盐缓冲液将另一个表位的PCT单克隆抗体、CRP单克隆抗体、ESAT～6～CFP10多克隆抗体、隐球菌荚膜多糖单克隆抗体分别稀释至1mgml，用于制备4条T线；用含1％蔗糖的50mM的磷酸缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1mgml，用于制备C线；按1μlcm划液量，通过biodot划膜仪将上述5种稀释后的抗体均匀得划至NC膜上制备T线和C线；将划好的NC膜放置于37℃干燥箱中，干燥3h。2样品结合垫的处理：玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液配方：100mMPBpH7.4，其中含有2％NaCl，2％BSA、0.5％酪蛋白、0.1％T～20、和5％蔗糖，前述百分比为质量百分比浸泡进行预封闭后，37℃干燥3h；通过Biodot仪器的airjet喷头，将标记有时间分辨荧光微球的抗体按照5μlcm的量超声喷雾至玻璃纤维素膜上，37℃干燥3h，制备得到样品结合垫。3组装：将步骤2得到的样品结合垫固定叠压在步骤1得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸样垫固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，两端的叠压长度均为2mm，用裁膜仪按每条4mm的宽度进行裁剪，即得成品。标准曲线的制作：首先，按试剂盒操作步骤测定PCT的6个不同浓度标准品的荧光值a：0ngmL、b:0.5ngmL、c:2ngmL、d:10ngmL、e:20ngmL、f:40ngmL，以标准品浓度的对数为横坐标，荧光值的对数为纵坐标，由双对数数学模型Log～Log函数处理，线性回归方程为Y＝0.8624X+3.0824，R2＝0.9995。PCT的TRFIA标准曲线见图2。同理，按试剂盒操作步骤测定CRP的8个不同浓度标准品的荧光值a:1μgml，b:5μgml，c:10μgml，d:50μgml，e:100μgml，f:150μgml，g:200μgml，h:250μgml，以标准品浓度的对数为横坐标，荧光值的对数为纵坐标，由双对数数学模型Log～Log函数处理，线性回归方程为Y＝0.8851X+3.9226，R2＝0.9994。CRP的TRFIA标准曲线见图3。同理，按试剂盒操作步骤测定ESAT～6～CFP10抗原的5个不同浓度标准品的荧光值a:2.5ngmL，b:25ngmL，c:100ngmL，d:500ngmL，e:1600ngmL，以标准品浓度的对数为横坐标，荧光值的对数为纵坐标，由双对数数学模型Log～Log函数处理，线性回归方程为Y＝1.2223X+2.6403，R2＝0.9999。ESAT～6～CFP10抗原的TRFIA标准曲线见图4。同理，按试剂盒操作步骤测定隐球菌荚膜多糖抗原的5个不同浓度标准品的荧光值a:1ngmL，b:10ngmL，c:50ngmL，d:100ngmL，e:500ngmL，以标准品浓度的对数为横坐标，荧光值的对数为纵坐标，由双对数数学模型Log～Log函数处理，线性回归方程为Y＝0.9689X+3.523，R2＝0.9997。隐球菌荚膜多糖抗原的TRFIA标准曲线见图5。精密度实验:采用上述试纸条对精确定量的高中低三个标准品浓度进行测定，各设置10个复孔。结果见表1。表1精密度实验由表1可知：上述试纸条的批内变异系数和批间变异系数均≤10％，符合试纸条规定要求。精确度实验：按照常规方法进行回收实验。结果见表2。表2回收实验由表2可知：PCT低中高三个浓度的回收率在100.39～102.67％之间，平均回收率为101.19％；CRP低中高三个浓度的回收率在99.09～100.20％之间，平均回收率为99.6％；ESAT～6～CFP10抗原低中高三个浓度的回收率在98.89～100.13％之间，平均回收率为99.63％；隐球菌荚膜多糖抗原低中高三个浓度的回收率在99.45～100.20％之间，平均回收率为99.87％。临床应用实验：取医院186例脑膜炎儿童阳性脑脊液，其中58例确诊为细菌性脑膜炎，54例确诊为病毒性脑膜炎，46例确诊为结核性脑膜炎，28例确诊为隐球菌性脑膜炎；再取114例健康儿童阴性脑脊液。具体检测步骤：将脑脊液试样滴加在样品结合垫上，静置5～20min后，将试纸条插入与试纸条配套的荧光分析仪中，分别读取C线、T1、T2、T3、T4线的荧光强度值。结果显示细菌性脑膜炎患者脑脊液PCT水平为12.94±4.64ngml，CRP水平为26.52±10.15μgml；病毒性脑膜炎患者脑脊液PCT水平为0.98±0.24ngml，CRP水平为6.78±3.2μgml；结核性脑膜炎患者脑脊液ESAT～6～CFP10抗原水平为137±48.4ngml；隐球菌性脑膜炎患者脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原水平为645±234ngml；健康儿童脑脊液PCT水平为0.14±0.11ngml，CRP水平为1.01±0.13μgml，ESAT～6～CFP10抗原水平为2.4±1.38ngml，隐球菌荚膜多糖抗原水平为1.14±0.32ngml，相较于隐脑患者较高的ESAT～6～CFP10抗原及隐球菌荚膜多糖抗原浓度，几乎可以忽略。上述检测结果均符合细菌性、病毒性、结核性、隐球菌性脑膜炎患者与健康儿童脑脊液中PCT、CRP、ESAT～6～CFP10抗原及隐球菌荚膜多糖抗原的参考值，说明本试纸条检测灵敏度和准确性较高，可对脑膜炎类型进行初筛。实施例2与实施例1基本相同，所不同的是：质控线C包被有羊抗鸡IgY；检测垫包括2条检测分垫，四条检测线随机地分布在2条检测分垫上，每条检测分垫上有两条检测线，每条检测分垫上均设有一条质控线，同一检测分垫上，相比于检测线质控线离吸样垫的端部最近。临床应用结果与实施例1一致，不再赘述。实施例3与实施例1基本相同，所不同的是：质控线C包被有羊抗兔IgG；检测垫还可以包括四条检测分垫，四条检测线随机地分布在四条检测分垫上，每条检测分垫上有一条检测线，每条检测分垫上均设有一条质控线，同一检测分垫上，相比于检测线质控线离吸样垫的端部最近。临床应用结果与实施例1一致，不再赘述。

权利要求：1.一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：包括：样品结合垫、检测垫、吸样垫和底板，样品结合垫、检测垫和吸样垫依次设置在底板上，且样品结合垫和吸样垫分别叠压在检测垫的两端上，检测垫上设有四条检测线和一条质控线。2.如权利要求1所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：其检测指标包括脑脊液中PCT、CRP、ESAT-6-CFP10抗原和隐球菌荚膜多糖抗原；样品结合垫内包被有时间分辨荧光微球标记的抗体，时间分辨荧光微球标记的抗体为检测指标的抗体。3.如权利要求1所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：样品结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、抗ESAT-6-CFP10多克隆抗体和抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体。4.如权利要求2或3所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：时间分辨荧光微球为修饰过的聚苯乙烯微球；聚苯乙烯微球表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，聚苯乙烯微球的粒径为100～500nm。5.如权利要求2或3所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：时间分辨荧光微球内部填充有1wt％镧系元素的螯合物，镧系元素为铕、钐、鈊或镝中的一种。6.如权利要求2或3所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：时间分辨荧光微球标记的方法为：包括顺序相接的如下步骤：1将时间分辨荧光微球溶于缓冲液中，加入活化剂恒温震荡活化；2将步骤1所得的物料中加入有机溶剂，混匀后，离心、洗涤除去活化剂，用缓冲液重悬微球，随后分别加入抗PCT单克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、抗ESAT-6-CFP10多克隆抗体及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，恒温震荡标记，离心后用复溶缓冲液重悬，加入封闭剂进行封闭，得到时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体复合物、抗CRP单克隆抗体复合物、抗ESAT-6-CFP10多克隆抗体复合物及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体复合物，用于PCT、CRP、ESAT-6-CFP10抗原以及隐球菌荚膜多糖抗原性能的评估。7.如权利要求6所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：步骤1和步骤2中的活化剂为1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或和N-羟基琥珀酰亚胺；步骤2中，有机溶剂为体积浓度为10％的乙醇，复溶缓冲液包括Tris-Hcl、BSA、T-20、海藻糖和NaCl。8.如权利要求2或3所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：四条检测线相互平行，四条检测线分别为能够与时间分辨荧光微球标记的抗体特异性结合的配对抗体所形成的涂层；四条检测线和一条质控线相互平行，且沿着检测垫的长度方向依次设置，从样品结合垫到吸样垫的方向上，依次是四条检测线和一条质控线；质控线包被有羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgY或羊抗兔IgG。9.如权利要求1-3任意一项所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：检测垫包括2～4条检测分垫，四条检测线随机地分布在检测分垫上，每条检测分垫上均设有一条质控线，同一检测分垫上，质控线比检测线离吸样垫的端部近；检测垫为硝酸纤维素膜、且为孔径5～12um的多孔膜；样品结合垫的材质为玻璃纤维素膜或无纺布；吸样垫的材质为吸水滤纸。10.权利要求1～9任意一项所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括顺序相接的如下步骤：1检测垫的处理：将检测垫贴在底板上，取含有1～5wt％蔗糖的10～50mM的pH7.4磷酸盐缓冲液将另一个表位的PCT单克隆抗体、CRP单克隆抗体、ESAT～6～CFP10多克隆抗体和隐球菌荚膜多糖单克隆抗体分别稀释至1±0.02mgml，用于制备四条检测线；用含有1～5wt％蔗糖的10～50mM的pH7.4磷酸缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1±0.02mgml，用于制备质控线；按1±0.02μlcm划液量，通过biodot划膜仪将上述5种稀释后的抗体均匀得划至检测垫上制备检测线和质控线；将划好的检测垫放置于37±3℃干燥箱中，干燥3±0.2h；2样品结合垫的处理：样品结合垫用含有表面活性剂的缓冲液浸泡进行预封闭后，37±3℃干燥3h±0.2h；通过Biodot仪器的airjet喷头，将标记有时间分辨荧光微球的抗体按照5±0.02μlcm的量超声喷雾至样品结合垫上，37±3℃干燥3h±0.2h，制备得到样品结合垫；3组装：将步骤2得到的样品结合垫固定叠压在步骤1得到的检测垫的一端，并将吸样垫固定叠压在检测垫的另一端，叠压长度均为1～4mm，用裁膜仪按每条4～6mm的宽度进行裁剪，即得可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条。

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